藤黄健骨胶囊通过SIRT1/PGC-1α/Nrf2信号通路抑制绝经后骨质疏松大鼠成骨细胞凋亡

安方玉, 王霞霞, 颜春鲁,3)*, 孙 柏, 汪春梅, 柳 颖, 常伟荣, 宋佳眙, 王玉洁, 马海珍, 张 蕊, 陈振东, 袁万英

(1)甘肃中医药大学教学实验实训中心, 兰州 730000;2)甘肃中医药大学中西医结合学院中医外科教研室, 兰州 730000;3)甘肃省中医药研究中心, 兰州 730000;4)甘肃中医药大学基础医学院免疫教研室, 兰州 730000;5)甘肃中医药大学医学教学部, 兰州 730000;6)定西市中医医院, 甘肃 定西 743099)

绝经后骨质疏松(postmenopausal osteoporosis,PMOP)是一种中老年女性绝经后最常见的原发性骨质疏松,该类患者绝经后卵巢分泌的雌激素减少,导致全身骨骼发生骨流失,其发病机制是破骨细胞介导的骨吸收大于成骨细胞介导的骨形成,破坏骨稳态,造成了骨丢失[1]。沉默交配型信息调节因子2同源蛋白1(silent mating type information regulator 2 homolog 1,SIRT1)是一种NAD+依赖性脱乙酰酶,已有研究发现,SIRT1在骨质疏松患者骨组织中呈低表达[2],在外周血单核细胞中活性也显著降低[3],因此,SIRT1与骨质疏松密切相关。另有研究表明,去卵巢(ovariectomized,OVX)大鼠股骨组织中SIRT1表达下降,补充雌激素后其表达量迅速回升,表明SIRT1的表达水平与雌激素呈正相关[4]。因此,作为雌激素缺乏诱发的绝经后骨质疏松,SIRT1是参与绝经后骨质疏松发病的关键分子,但SIRT1调控绝经后骨质疏松的具体机制尚不清楚。

中医认为绝经后骨质疏松属于“骨痹”和“骨枯”等范畴[5],其主要病理机制以“肾虚精亏”为本,“瘀血阻络”为标,因此,中医治疗绝经后骨质疏松遵循“补肾壮骨,活血通络”的原则。本研究选用具有“补肾活血”作用的藤黄健骨胶囊(tenghuangjiangu capsule,TJC),其主要由熟地黄、鹿衔草、骨碎补(烫)、肉苁蓉、淫羊藿、鸡血藤和莱菔子等组成,诸药合用,具有“补肾壮骨,活血止痛”的功效。本课题组前期研究表明,藤黄健骨胶囊具有类雌激素的作用,对绝经后骨质疏松有明确疗效[6],但其治疗绝经后骨质疏松的具体机制仍不明确。综上,本文通过藤黄健骨胶囊干预去卵巢大鼠模型(PMOP大鼠),观察其对绝经后骨质疏松大鼠SIRT1/PGC-1α/Nrf2信号通路中关键分子表达的影响,阐明藤黄健骨胶囊通过SIRT1信号通路调控骨代谢的机制,为临床上防治PMOP提供实验与理论依据,同时为中医药防治骨质疏松提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选用12周龄SD雌性大鼠60只,体重200±20 g,购自甘肃中医药大学科研实验动物繁殖中心,实验动物质量合格证编号:SCXK(甘)2020-0001。该实验严格遵循甘肃中医药大学实验动物伦理委员会制定的原则进行。

1.2 药物与试剂

藤黄健骨胶囊(甘肃省西峰制药有限责任公司,规格0.25 g/粒,批号:210108);戊酸雌二醇片(estradiol valerate tablets,ESV)(拜耳医药保健有限公司,规格1 mg/片,批号:676A);SIRT1兔单克隆抗体和过氧化物酶体增殖物激活受体-γ共激活因子-1α(peroxisome proliferator activated receptor-γ co activation factor-1α,PGC-1α)兔单克隆抗体(Abcam,批号分别为:GR3283936-26和GR328393626);GAPDH、核因子-E2相关因子2(nuclearfactor erythroidderived 2-like 2,Nrf2)、Runt相关转录因子2(runt related transcription factor 2,Runx2)和胱天蛋白酶9(caspase-9)兔单克隆抗体(Immuno Way,批号分别为:014121、138901、135601和136201);Bcl-2和胱天蛋白酶(caspase-3)兔单克隆抗体(Gene Tex,批号分别为:42970和822105972);TUNEL染色试剂盒(Elabsocience,批号:AK0584ZN2627)。

1.3 实验仪器

Arcadia C型生物组织石蜡包埋机(徕卡显微系统(上海)贸易有限公司);IX51型数码显微镜(日本OLYMPUS);Quantstudio3荧光定量PCR仪(美国Thermo Fisher Scientifc);Chemi Doc XRS凝胶成像分析系统(美国BIO-RAD)。

1.4 药物剂量换算

藤黄健骨胶囊(TJCs)的人用剂量是2 g/d,人(70 kg)与大鼠(200 g)的体表面积系数0.018计算得:2 g/d×0.018/0.2 kg=0.18 g/kg/d,此剂量为藤黄健骨胶囊的中剂量。则藤黄健骨胶囊的干预剂量分别为:高剂量(hTJC)0.36 g/kg/d、中剂量(mTJC)0.18 g/kg/d、低剂量(lTJC)0.09 g/kg/d。阳性对照药戊酸雌二醇片的人用剂量是1 mg/d,同样换算得:1 mg×0.018/0.2 kg=0.09 mg/kg/d,依此剂量为戊酸雌二醇片的干预剂量,作为阳性对照。

1.5 绝经后骨质疏松大鼠模型构建

依据参考文献[7],PMOP大鼠模型构建步骤如下:大鼠麻醉后,采取俯卧位,备皮后消毒手术区皮肤;沿背部后正中线作纵形切口长约1.0～1.5 cm,找到卵巢并结扎子宫角后摘除卵巢,然后伤口逐层缝合,同样方式切除对侧卵巢。而假手术组大鼠只切卵巢附近白色脂肪组织,注意术后保温。

1.6 动物分组及干预

建模8周时,大鼠随机分为去卵巢模型组(OVX)、阳性对照组(ESV)、不同剂量TJC治疗组(hTJC、mTJC、lTJC),每组10只,另外设置10只作为假手术组(Sham)。阳性对照组和TJC治疗组分别给予相应药物灌胃,假手术组和模型组则给予蒸馏水灌胃,连续灌胃2月。干预结束后手术完整切取大鼠左侧和右侧整个股骨组织,TUNEL染色观察成骨细胞的凋亡情况;qPCR检测SIRT1/PGC-1α/Nrf2通路关键分子基因转录水平变化;双重免疫荧光染色和Western印迹观察SIRT1/PGC-1α/Nrf2通路关键分子蛋白质水平等。

1.7 TUNEL染色观察成骨细胞的凋亡情况

将切片浸入蛋白酶K工作液37 ℃ 20 min;加入100 μL TdT 平衡缓冲液(equilibration buffer) 37 ℃ 20 min,加入50 μL标记工作液,37 ℃避光反应60 min;加DAPI工作液,室温下避光反应5 min,对细胞核进行复染;PBS洗涤后用含抗荧光淬灭剂的封片剂进行封片。荧光显微镜下观察图像并拍照。DAPI染色的细胞核呈蓝色,阳性凋亡细胞呈绿色。使用Image J分析软件分别进行总细胞(蓝色)和凋亡细胞(绿色)计数;凋亡率为凋亡细胞数目/总细胞数×100%。

1.8 双重免疫荧光染色观察SIRT1/PGC-1α/Nrf2通路关键分子表达变化

骨钙素(osteocalcin,BGP)为成骨细胞特异性标志物,采用双重免疫荧光分别检测大鼠股骨组织中BGP蛋白与SIRT1、PGC-1α、Nrf2蛋白质共表达的情况,具体方法如下:将切片置于3%的H2O2避光10 min;100 mmol甘氨酸中和15 min;封闭液室温封闭1 h;弃封闭液后在切片组织上同时滴加BGP抗体(1∶200)和SIRT1(1∶100)/PGC-1α(1∶100)/Nrf2(1∶100)4 ℃孵育过夜;滴加二抗室温避光孵育l h;然后用DAPI染核3 min,用PBS-Triton洗3次再用抗荧光淬灭剂封片;荧光倒置扫描显微镜观察,Image J分析数据。判定标准根据试剂说明书:BGP呈绿色,SIRT1、PGC-1α、Nrf2呈红色,DIPA细胞核呈蓝色,双染的共定位阳性细胞经叠加后呈黄色。

1.9 qPCR测定SIRT1/PGC-1α/Nrf2通路关键分子转录水平变化

Trizol试剂提取右侧股骨组织及股骨细胞中总RNA,使用YEASEN公司生产的试剂盒和实时荧光定量分析试剂盒分别逆转录合成cDNA并进行qPCR目的基因的扩增反应,分析SIRT1/PGC-1α/Nrf2通路关键分子SIRT1、PGC-1α、Nrf2、Runx2、Bcl-2、Caspase-3和Caspase-9 mRNA表达。2-△△Ct法量化SIRT1/PGC-1α/Nrf2通路关键分子SIRT1、PGC-1α、Nrf2、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9、NFATc1和Runx2相对表达水平。qPCR反应引物见Table1。

1.10 Western印迹测定SIRT1/PGC-1α/Nrf2通路关键分子表达变化

称取0.1 g股骨组织,加入1 000 μL RIPA裂解液(980 μL RIPA+20 μL PMSF)12 000 r/min离心,所得上清液为总蛋白质;依据BCA试剂盒说明书测定各组样品中的蛋白质浓度,加入4×蛋白质上样缓冲液,将各组样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳和转膜;用TBS-T缓冲液(含5%脱脂奶粉)在37 ℃将PVDF膜封闭1 h,滴加封闭液稀释的一抗SIRT1、PGC-1α、Nrf2、Runx2、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9于PVDF上,一抗工作液与PVDF膜4 ℃过夜孵育;第2 d,TBS-T缓冲液洗膜后加入二抗工作液室温孵育1 h;使用ECL发光底物进行化学发光显色,用ECL化学发光系统拍照。用Image J图像分析软件进行处理与分析。

1.11 统计学方法

2 结果

2.1 藤黄健骨胶囊抑制绝经后骨质疏松模型鼠成骨细胞凋亡

TUNEL染色观察绝经后骨质疏松模型鼠股骨组织成骨细胞的凋亡情况,结果如Fig.1和Table 1所示。Sham组大鼠股骨组织中有少量绿色凋亡阳性细胞,OVX组大鼠股骨组织中出现大量绿色凋亡阳性细胞、其凋亡率(均值为85.86)比Sham组明显增加(均值为38.28);而ESV组和hTJC组、mTJC组、lTJC组大鼠股骨组织中绿色凋亡阳性细胞均减少,其细胞凋亡率(均值为56.91、64.79、72.68、73.80)比OVX组明显减少(均值为85.86),尤以ESV组和hTJC组绿色凋亡阳性细胞、细胞凋亡率减少最明显。提示藤黄健骨胶囊可以抑制股骨组织成骨细胞的凋亡。

Fig.1 The effects of TJC on the osteoblastic apoptosis in rats with postmenopausal osteoporosis

Table 1 Effects of TJC on the apoptosis rate of osteoblast in rats with postmenopausal n=6)

2.2 藤黄健骨胶囊增强绝经后骨质疏松模型鼠成骨细胞SIRT1、PGC-1α、Nrf2免疫荧光强度

用双重免疫荧光染色法,观察SIRT1、PGC-1α和Nrf2在股骨成骨细胞中的表达情况(双染共定位呈黄色),结果如图Fig.2和Fig.3所示。与Sham组相比,SIRT1、PGC-1α和Nrf2在OVX组大鼠股骨成骨细胞中的表达(均值为4.47、6.17、2.84)均明显低于Sham组(均值为33.28、14.43、17.84);PGC-1α在ESV组和hTJC组、mTJC组大鼠股骨成骨细胞中的表达(均值为12.23、11.27、9.07)均明显高于OVX组(均值为6.17),SIRT1和Nrf2在ESV组和hTJC组、mTJC组、lTJC组大鼠股骨成骨细胞中的表达(均值为25.74/13.56、19.37/18.21、16.20/12.63、9.00/5.52)均明显高于OVX组(均值为4.47/2.84)。提示藤黄健骨胶囊抑制绝经后骨质疏松模型鼠成骨细胞凋亡与SIRT1/PGC-1α/Nrf2信号轴有关。

Fig.2 The effects of TJC on the SIRT1, PGC-1α, Nrf2 protein expression of osteoblasts in rats with postmenopausal osteoporosis

Fig.3 The effects of TJC on the SIRT1, PGC-1α, Nrf2 fluorescence area of osteoblasts (BGP) in rats with postmenopausal osteoporosis

2.3 藤黄健骨胶囊对绝经后骨质疏松模型鼠SIRT1/PGC-1α/Nrf2通路关键分子mRNA表达变化的作用

qPCR测定SIRT1/PGC-1α/Nrf2通路关键分子转录水平变化,结果如Fig.4所示。与Sham组相比,OVX组股骨组织中STRT1、PGC-1α、Nrf2、Runx2和Bcl-2等mRNA的表达水平均明显降低,而胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶9等mRNA的表达水平明显升高(P<0.01);与OVX组相比,ESV组和hTJC组、mTJC组Runx2 mRNA的表达水平明显升高,ESV组和hTJC组、mTJC组、lTJC组STRT1、PGC-1α、Nrf2和Bcl-2等mRNA的表达水平均明显升高,而胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶9等mRNA的表达水平均明显降低(P<0.05或P<0.01)。提示藤黄健骨胶囊在转录水平通过激活绝经后骨质疏松模型鼠SIRT1/PGC-1α/Nrf2信号关键分子SIRT1、PGC-1α、Nrf2、Bcl-2、Runx2的表达,同时抑制该通路的胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶9的表达来抑制其成骨细胞凋亡。

Fig.4 The effects of TJC on the mRNA expression levels of key molecules of SIRT1/PGC-1α/Nrf2 pathway in rats with postmenopausal osteoporosis

2.4 藤黄健骨胶囊对绝经后骨质疏松模型鼠SIRT1/PGC-1α/Nrf2通路关键分子蛋白质表达的影响

利用Western印迹测定SIRT1/PGC-1α/Nrf2通路关键分子蛋白质表达的变化,结果如Fig.5所示。与Sham组相比,模型组股骨组织中SIRT1、PGC-1α、Nrf2、Runx2和Bcl-2等分子表达水平均明显降低,而胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶9等分子表达水平则均明显升高(P<0.01);与模型组相比,ESV组和hTJC组、mTJC组Nrf2和Runx2等分子表达水平均明显升高,而胱天蛋白酶9分子表达明显降低,ESV组和TJC组、mTJC组、lTJC组SIRT1、PGC-1α和Bcl-2等分子表达水平也均明显升高,而胱天蛋白酶3分子表达水平明显降低(P<0.05或P<0.01)。提示藤黄健骨胶囊在翻译水平通过激活绝经后骨质疏松模型鼠SIRT1/PGC-1α/Nrf2信号关键分子SIRT1、PGC-1α、Nrf2、Bcl-2、Runx2的表达,同时抑制该通路的胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶9的表达来抑制其成骨细胞凋亡。

Fig.5 The effects of TJC on the protein expression levels of key molecules of SIRT1/PGC-1α/Nrf2 pathway in rats with postmenopausal osteoporosis

3 讨论

利用祖国医学结合绝经后骨质疏松的发病特点,将其归属“骨痹”范畴,认为其主要病机以“肾虚精亏”为本,“瘀血阻络”为标,当以“补肾活血”为根本[8,9]。藤黄健骨胶囊方中重用君药熟地黄,能够发挥滋阴补血、益精填髓之功效;淫羊藿、肉苁蓉、骨碎补和鹿衔草等作为臣药合用具有补肾强骨、益精生髓、除湿止痛之功效;佐药鸡血藤能够发挥补肾益精、通经活血之功效;使药莱菔子可以发挥理气健骨之功效;诸药合用,共凑补肾精填和活血止痛的功效[10]。课题组前期研究结果已证实,藤黄健骨胶囊能够通过改变OVX模型大鼠股骨生物力学性能来修复其骨微结构的破坏[6],但具体的调控机制未明。

在正常情况下,骨组织中成骨细胞和破骨细胞处于动态平衡以维持骨代谢稳态;而绝经期女性因卵巢功能衰退引起雌激素水平下降,使得成骨细胞减少、破骨细胞增多,破坏了成骨与破骨的平衡,导致绝经后骨质疏松症的发生[11,12]。研究结果证实,SIRT1是调控成骨细胞与破骨细胞稳态的关键分子[13]。目前也有研究证实,骨质疏松患者血清中SIRT1表达量较健康体检者显著下降[14]。本研究结果也证实,OVX模型鼠SIRT1的表达在转录水平、翻译水平均显著降低,且双重免疫荧光染色结果显示其成骨细胞中SIRT1的荧光表达面积也显著降低,与上述述研究报道结果一致。而藤黄健骨胶囊可以逆转这一现象。但是SIRT1的下调具体是通过什么样的分子机制来调控绝经后骨质疏松成骨细胞与破骨细胞之间的稳态,藤黄健骨胶囊治疗绝经后骨质疏松是否与SIRT1有关,目前尚未深入研究。

SIRT1和PGC-1α等分子是PGC-1α/Nrf2信号通路的重要组成成分[15]。研究发现,SIRT1的激活能上调PGC-1α的表达,从而促进成骨分化,推测SIRT1作为PGC-1α的上游调控因子来发挥促进成骨分化的作用[16-18]。其他研究结果进一步证实,SIRT1可以调节成骨细胞的凋亡来影响其骨形成[19,20]。Liu等人发现,SIRT1抑制剂EX527通过抑制SIRT1来抑制SIRT3的活性并促进p66Shc表达,增强细胞内活性氧水平,促进H2O2诱导的成骨细胞凋亡[21]。Wang等人提出,激活PGC-1α/Nrf2通路,可提高抗氧化应激能力,并参与炎症反应、细胞凋亡等生物过程[22],其他研究也发现,PGC-1α同时可以激活Nrf2的表达[23,24]。本研究结果也显示,OVX模型鼠SIRT1、PGC-1α、Nrf2的表达在转录水平、翻译水平均显著降低,且双重免疫荧光染色结果显示,其成骨细胞中SIRT1、PGC-1α、Nrf2的荧光表达面积也均明显升高,这一结果与上述研究报道趋于一致。而藤黄健骨胶囊可以逆转这一现象,证明藤黄健骨胶囊治疗绝经后骨质疏松可能与SIRT1/PGC-1α/Nrf2信号通路的激活密切相关。

此外,Deng等人又提出,SIRT1通过脱乙酰化p53和升高Bax/Bcl-2比值来诱导成骨细胞凋亡[25,26]。而另有研究则进一步证实,Bcl-2的上调表达和Bax、Caspase-3、Caspase-9的下调表达与Nrf2信号通路的激活密切相关,而Nrf2信号通路的激活又能够抑制成骨细胞的凋亡,从而减少骨丢失[27]。本文结果发现,藤黄健骨胶囊能够抑制OVX模型鼠成骨细胞的凋亡率,上调Nrf2、Runx2、Bcl-2的mRNA表达水平及蛋白质表达水平,下调Caspase-3、Caspase-9的mRNA表达水平及蛋白质表达水平。由此推测,藤黄健骨胶囊可能通过SIRT1介导的Nrf2信号轴来发挥抗PMOP作用。

综上,藤黄健骨胶囊可能通过激活SIRT1/PGC-1α/Nrf2信号通路中成骨细胞生成因子RUNX2的表达来促进PMOP的成骨形成,也能够通过激活SIRT1/PGC-1α/Nrf2信号通路中SIRT1、PGC-1α、Nrf2、Bcl-2表达和抑制促凋亡蛋白质Caspase-3、Caspase-9表达来抑制PMOP的成骨细胞凋亡,进而维持PMOP的骨代谢平衡,最终发挥疗效。