假尿苷修饰体外转录mRNA在翻译过程中发生的+1核糖体框架移码

于永利

(吉林大学基础医学院免疫系, 长春 130021)

2023年, 诺贝尔生理学/医学奖授予了卡塔林·卡里科(Katalin Karik)和德鲁·韦斯曼(Drew Weissman),表彰她们为研制、生产严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)mRNA疫苗(SARS-CoV-2 mRNA疫苗) 做出的贡献[1,2]。在美国宾夕法尼亚大学工作期间,卡里科和韦斯曼建立了体外转录(in vitro-transcription, IVT) 制备假尿苷(pseudouridine)修饰信使RNA(mRNA)的技术[3]。Pfizer/BioNTech 公司和Moderna公司采用该技术生产出SARS-CoV-2 mRNA疫苗[4]。这些疫苗的“抗原”成分是编码SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)的假尿苷修饰mRNA[5]。自从SARS-CoV-2爆发流行以来,Pfizer/BioNTech 和Moderna生产的SARS-CoV-2 mRNA疫苗,联同其他SARS-CoV-2疫苗,在全世界被应用了130多亿剂[1]。

新年伊始,一项研究揭示,假尿苷修饰mRNA在翻译时会出现+1核糖体框架移码(+1 ribosomal frameshifting),产生异常的蛋白质产物。这些产物可能引起非预想的后果(unintended consequences)[6,7]。

1 RNA转录本的核苷酸修饰

天然状态下,RNA转录物本(RNA transcripts)的核苷酸修饰发生在转录后,存在于包括古细菌、细菌和真核生物的所有生命体[8]。已发现的核苷酸修饰超过140种,以6-甲基腺嘌呤[m(6)A]、5-甲基胞嘧啶[m(5)C]和假尿嘧啶(Ψ)修饰较为常见[9]。

发生核苷酸修饰最多的RNA转录本是转移RNA(transfer RNAs, tRNAs)10]。这些修饰关系 tRNA的折叠、稳定和解码(decoding)[11,12]。核糖体RNA(ribosomal RNAs, rRNA)的核苷酸修饰主要发生在结构保守功能区,关系核糖体的组装[13]。

细菌、人和酵母的mRNA都可发生核苷酸修饰。细菌mRNA编码区有丰富的m(6)A[14]。在体外翻译实验中发现,从含m(5)C 的细菌mRNA密码子翻译出了非该密码子编码的氨基酸[15]。这揭示,修饰核苷酸会引起“核酸序列非依赖性氨基酸突变”。人mRNA 存在广泛的m(5)C[16]修饰。在酵母和人的mRNA,天然存在Ψ,其数量受假尿苷合成酶(pseudouridine synthases)调节[17,18]。Ψ既影响mRNA的半衰期[19]和结构[20,21],也影响其翻译保真。位于mRNA开放阅读内的Ψ可引起翻译蛋白质的氨基酸替换[17]。在大肠杆菌中,tRNA可“读过”(read-through)含Ψ的终止密码 (ΨAA, ΨAG, ΨGA)。这揭示,Ψ可使终止密码 失去终止蛋白质翻译的的功能[22]。不仅如此,Ψ还可以使终止密码变成特定氨基酸的密码子,如ΨAA是丝氨酸的密码子, ΨAG编码苏氨酸,ΨGA 编码酪氨酸或苯丙氨酸[23]。这些工作提示,假尿嘧啶修饰IVT mRNA(Ψ-IVT mRNA)在翻译时可能产生“异常”蛋白质。

2 Ψ-IVT mRNA在翻译过程中发生的+1核糖体框架移码

为了研究Ψ-IVT mRNA[24]的翻译保真,Mulroney等设计了能检测+1 核糖体框架移码(+1 ribosome frameshifting)的Fluc+1FS mRNA的报告系统。+1核糖体框架移码是指在翻译蛋白质时,核糖体在mRNA 上滑过了1个密码子的第1个核苷酸,结果使该密码子的第2个核苷酸成为“紧邻”下游密码子的第1个核苷酸,第3个核苷酸成为“次邻”下游密码子的第1个核苷酸,结果使翻译蛋白质发生移码“突变。突变点上游的蛋白质处于“正框”(in-frame),下游 的 “出框”(out-of-frame)。“出框”使蛋白质的下游 “面目全非”。若读出新的终止密码,也会产生未成熟(截短)蛋白质。Fluc+1FS mRNA的上游是编码萤火虫发光素酶(Fluc)氨基端的mRNA(NFluc mRNA),下游是编码Fluc羧基端的mRNA(CFluc mRNA)。NFluc mRNA是正框mRNA。CFluc mRNA是+1框架(+1 frame) mRNA。采用体外转录方法制备Fluc+1FS mRNA在兔网织红细胞裂解物翻译Fluc。若产生了无发光催化活性的蛋白质,说明Fluc+1FS mRNA翻译时未发生+1核糖体框架移码。因为,未发生+1核糖体框架移码的Fluc+1FS mRNA不能翻译出正框CFluc。若产生有发光催化活性的蛋白质,说明Fluc+1FS mRNA在翻译时发生+1 核糖体框架移码。因为,发生+1核糖体框架移码可纠正的CFluc mRNA的+1出框,使其恢复“正框”,进而产生有发光催化活性的全长Fluc。这样,检测萤火虫发光素酶的活性就可判定Fluc+1FS mRNA在翻译过程中是否出现+1核糖体框架移码。有活性,指示发生了+1核糖体框架移码;无活性,指示未发生+1核糖体框架移码。活性高,代表发生+1 核糖体框架移码的蛋白质多;活性低,代表正框的蛋白质多[6,7]。

Mulroney等采用体外翻译方法制备了假尿苷(Ψ)修饰Fluc+1FS mRNA(Ψ-Fluc+1FS mRNA),采用兔网织红细胞裂解物翻译了Ψ-Fluc+1FS mRNA,检测翻译产物的发光催化活性。结果是:(1)从野生型Fluc mRNA 翻译出高发光催化活性蛋白质;(2)从未修饰Fluc+1FS mRNAs翻译出无发光催化活性蛋白质,证明翻译时未发生+1 核糖体框架移码;(3)从Ψ-Fluc+1FS mRNA 翻译出有发光催化活性的蛋白质,证明翻译时发生+1 核糖体框架移码。这揭示,Ψ-IVT mRNA在翻译时发生+1 核糖体框架移码,产生了非预想(unintended) 蛋白质[6,7]。

进一步研究发现,从Ψ-Fluc+1FS mRNA 翻译出+1核糖体框架移码蛋白质(+1移框蛋白质)的比率占正框蛋白的 8%;Ψ-IVT mRNA在Hella 细胞中也翻译出了+1移框蛋白质;用免疫印记(Western blotting)方法可检测到从Ψ-IVT mRNA翻译出的+1移框蛋白质[6,7]。

3 假尿苷修饰SARS-CoV-2 S 蛋白编码mRNA的+1核糖体框架移码

SARS-CoV-2 mRNA 疫苗(Pfizer/BioNTech公司生产的BNT162b2和Moderna 公司生产的mRNA-1273)的“抗原”是编码SARS-CoV-2 刺突蛋白(S蛋白)的Ψ-IVT mRNA[6]。

为了判定SARS-CoV-2 mRNA 疫苗是否会产生+核糖体框架移码蛋白质,Mulroney等用BNT162b2免疫小鼠,然后检测其脱靶T细胞反应(off-target T-cell responses)。检测方法是干扰素-γ (IFNγ)免疫斑点试验(IFNγ-ELISpot)。免疫后,BNT162b2中编码SARS-CoV-2 S蛋白的Ψ-IVT mRNA被递送入抗原提呈细胞(antigen presenting cell, APC)。在APC中,Ψ-IVT mRNA被翻译成“正框”S蛋白。S蛋白的T细胞表位(抗原肽)被APC提呈给T淋巴细胞(T 细胞)使其激活。激活的T细胞产生干扰素。用IFNγ-ELISpot检测产生IFNγ 的T细胞(IFNγ+T细胞)的数量,可判定T细胞的激活。携带T细胞表位的抗原肽(合成肽)能刺激特异性T细胞产生IFNγ。IFNγ+T细胞能在IFNγ-ELISpot中形成斑点。斑点颜色越深,指示IFNγ产生越多。斑点密集,指示IFNγ+T细胞多。免疫后,若BNT162b2中的编码SARS-CoV-2 S蛋白的Ψ-IVT mRNA在翻译时发生+核糖体框架移码,就会产生+1移框蛋白质。+1移框蛋白质上会出现新的T细胞表位。新T细胞表位诱导脱靶T细胞反应。脱靶是指不针对SARS-CoV-2 S蛋白。携带+1核糖体框架移码蛋白T表位的抗原肽(合成肽)可激活特异性T细胞产生IFNγ,使其成为特异性IFNγ+T细胞。采用IFNγ-ELISpot计量这种细胞,就可以判定编码SARS-CoV-2 S蛋白的Ψ-IVT mRNA在翻译时是否发生了+1核糖体框架移码。因为,+1移框蛋白质是携带新T细胞表位的异常蛋白质[6]。在BNT162b2免疫小鼠体内,既检测到靶向SARS-CoV-2 S蛋白的T细胞反应,也检测到脱靶T细胞反应。相比之下,在 ChAdOx1 nCoV-19免疫小鼠,仅能检测到靶向SARS-CoV-2 S蛋白的T细胞反应。ChAdOx1nCoV-19是阿里斯康公司生产腺病毒载体SARS-CoV-2 疫苗,属非mRNA 疫苗(non-mRNA vaccine)。这些结果表明,从BNT162b2 S蛋白编码Ψ-IVT mRNA翻译出了+1核糖体框架移码蛋白质,这些蛋白质诱导脱靶T细胞免疫(off-target T cell immunity)[6]。

在21 位免疫BNT162b2的志愿者,也检测到了+1核糖体框架移码蛋白质诱导的脱靶T细胞反应。相比之下,在20位免疫ChAdOx1 nCoV-19的志愿者,仅检测到了靶向SARS-CoV-2 S蛋白的T细胞反应。这表明,BNT162b2 S蛋白编码Ψ-IVT mRNA在人体内翻译时也发生了+核糖体框架移码[6]。

4 假尿嘧啶修饰 mRNA +1框架移码的发生机制

用35S-甲硫氨酸掺入法测定Ψ-IVT Fluc mRNA和IVT Fluc mRNA 的体外翻译速率时发现:(1)在30 min内,和IVT Fluc mRNA相比,从Ψ-IVT Fluc mRNA 翻译出的全长Fluc(萤火虫发光素酶)显著减少。这指示了翻译速率减慢。减慢的原因可能是核糖体滑动“滞顿”;(2)Ψ-IVT Fluc mRNA 翻译出较高比例的截短肽。这表明,Ψ使IVT Fluc mRNA在翻译发生+1核糖体框架移码;(3)巴龙霉素可以提高Ψ-IVT Fluc mRNA 的翻译速率。这提示,核糖体滑动滞顿由tRNA 的反密码子和mRNA的含Ψ密码子的“匹配”不佳引起。在蛋白质翻译解码过程中,携带氨基酸的-tRNA 的反密码子和mRNA 上的密码子相互识别、作用,导致 18S rRNA 局部构象变化和新肽键形成。若tRNA 的反密码子和mRNA的密码子结合不 “严丝合缝”,核糖体的滑动就会减慢,出现“滞顿”。“滞顿”可导致tRNA 跳过1个核苷(skip a nucleotide)。这样,+1核糖体框架移码就发生了[6]。巴龙霉素与延伸核糖体(elongating ribosomes)中的18S rRNA 结合并改变其在解码中心的构象,促进tRNA 的反密码子和mRNA上匹配不佳的密码子之间的识别、作用,因而可以改善假尿苷诱导的核糖体滞顿(pseudouridine-induced ribosome stalling)[6]。

5 问题与展望

伴随着SARS-CoV-2 mRNA疫苗的应用,Ψ-IVT mRNA 已/正出现在以多种疾病为适应症的mRNA疫苗/药物的临床前和临床研究(preclinical and clinical studies)中[25-32]。

Ψ-IVT mRNA在翻译过程中发生+1核糖体框架移码现象的揭示了一系列应该关注和探讨的问题:应用SARS-CoV-2 mRNAs疫苗可能引起“非预期反应”。+1核糖体框架移码使SARS-CoV-2 mRNAs疫苗“短斤少两”,效力下降。因为+1移框蛋白质是脱靶蛋白质,不诱导针对SARS-CoV-2 S蛋白的保护性免疫反应。不仅如此,脱靶蛋白质可能有如下副作用:(1)刺激产生诱骗抗体(decoy antibody)。诱骗抗体不能有效结合SARS-CoV-2 S蛋白而阻断SARS-CoV-2进入宿主细胞。诱骗抗体可能促进SARS-CoV-2感染。(2)诱发自身免疫性疾病。脱靶蛋白质可能存在与自身成分有同源性的“新”T细胞表位和B细胞表位,针对这些表位的脱靶T细胞和脱靶抗体(off-target T-cell or antibody)可能会攻击自身细胞。(3)展现毒性。脱靶蛋白质可能多种多样。一旦有毒,可造成直接伤害。

要重新审视以Ψ-IVT mRNA为基础的mRNA疫苗/药物的合理性。在IVT mRNA中掺入Ψ的主要目的是消除其激发炎症反应的性质[3]。细想一下,抗传染病疫苗和肿瘤疫苗中的IVT mRNA若能激发非特异性炎症反应未尝不是一种想要的性质。疫苗需有佐剂。有效的佐剂应能激发炎症反应。未经Ψ修饰的IVT mRNA可能是一种“抗原分子内佐剂”。因此,似可考虑采用“不修饰”的IVT mRNA研制疫苗。

有必要采用其他核苷酸取代Ψ研制IVT mRNA疫苗/药物。并不是所有的核苷酸修饰的IVT mRNA都会在翻译蛋白质时发生+1核糖体框架移码。

鉴于+1核糖体框架移码的发现,有必要在研制IVT mRNA疫苗/药物的临床前和临床试验中“确证” IVT mRNA的翻译保真(translation fidelity)性。