婴配乳粉中2′-岩藻糖基乳糖和乳糖-N-新四糖含量离子色谱法检测

詹胜群 葛 城 周荣杰 周 钧

（澳优乳业（中国）有限公司， 长沙 410200）

母乳低聚糖（HMOs）是一种多功能聚糖，是人乳中的第三大成分［1］，其结构主要由5 种基本单糖组成： 葡萄糖（Glucose， Glc）、半乳糖（Galactose， Gal）、N-乙酰葡糖氨（Nacetylglucosamine， GlcNAc）、岩藻糖（Fucose， Fuc）和N-乙酰神经氨酸（N-Acetylneuraminic acid， NeuAc），通常由半乳糖和葡萄糖与其它一种或多种单糖聚合形成多种结构［2］。HMOs 对于婴幼儿的生长健康有着重要的意义，除了可预防感染、过敏以外，还能促进肠胃发育、增强自身免疫、预防糖尿病和心血管疾病［3-5］等。

作为婴幼儿主要食物来源之一的婴幼儿配方乳粉，早已朝着母乳化的方向发展，于2017 年欧盟委员会发布执行决定（EU）2017/2201，授权批准以大肠杆菌BL21 产生的2'-岩藻糖基乳糖（2′-FL）作为新型食品成分，授权2′-FL 粉和液体浓缩物在婴儿配方奶粉和以及较大婴儿配方奶粉中使用。我国在2022 年发布了国食评函［2022］234 号《国家食品安全风险评估中心关于征求聚天冬氨酸钾等11 种食品添加剂新品种相关意见的函》，其中就包括了HMOs 中含量丰富的2 种寡糖： 2′-FL 和乳糖-N-新四糖（LNnT）。但是截至今日，国内暂时没有规定针对婴幼儿配方乳粉中2′-FL 和LNnT 的标准检测方法，因此，为保障婴幼儿配方乳粉产品质量，针对婴幼儿配方乳粉中这两种HMOs 建立一种准确、易复现的检测方法十分必要。

目前，各国学者对于HMOs的测定均有研究，主要测定方法有： 高效液相色谱法［6-9］、液相色谱-串联质谱法［10-14］和离子色谱法［15-17］等。高效液相色谱法一般搭配紫外检测器或荧光检测器，但由于母乳低聚糖紫外吸收能力弱、荧光性差，一般需要先进行衍生反应［18］才能进行检测，而且多数衍生剂存在一定毒害性，且衍生反应过程步骤复杂。Christensen 等［6］便采用了这种方式对乳粉中的2′-FL 和3′-FL 进行了测定。液相色谱-串联质谱法也是分析低聚糖的方法之一，其快速测定、高灵敏度以及通过特征碎片进行准确定性使得该方法也是HMOs 的热门方法之一，Mank 等［14］便采用了液相色谱-串联质谱法分析了HMOs 和相关的人乳基团。然而，液相色谱-串联质谱法也有其不足之处，由于低聚糖不耐热易碳化的特性，在质谱离子源脱溶剂和离子传输过程中容易受热裂解，导致响应较差重复性欠佳。离子色谱法是检测糖类常用的方法之一，例如聚葡萄糖、低聚果糖等的国标方法便是采用离子色谱法，美国分析化学家族协会（AOAC）也收录采用离子色谱法测定低聚半乳糖的资料文献，如AOAC 官方方法2001.02 版：精选食品中反式低聚半乳糖含量的测定。离子色谱法通过搭载电化学检测器，利用糖在电极表面的氧化还原反应来从而可以直接对糖类做出响应，避免对样品进行衍生化处理［19］，因此对于母乳低聚糖的研究，采用离子色谱法能够减少操作步骤、降低不确定因素的影响，便于实验室后续使用。本实验通过对婴幼儿配方乳粉中2′-FL和LNnT的提取方式进行比对探究，并不断调整淋洗液比例，从而建立其能够同时检测2′-FL和LNnT的离子色谱法，方法简单便捷，能够为婴幼儿配方乳粉中2′-FL 和LNnT 含量的监测提供参考。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

Dionex ICS-6000 型高效离子色谱仪（HPIC，美国Thermo-Fisher 公司）；Milli-Q 型超纯水仪（美国Millipore 公司）；FE28 型pH 计、ME204E 型电子天平（美国METTLER TOLEDO 公司）；CarboPac™ PA1 色谱柱（10.0 μm，4×250 mm）及其保护柱（10.0 μm，4×50 mm）、CarboPac ™ PA200 色谱柱 （5.5 μm，3×250 mm）及其保护柱 （5.5 μm，3×50 mm） （美国Thermo-Fisher公司）。

亚铁氰化钾（K4［Fe（CN）6］，分析纯）购自国药集团化学试剂有限公司；乙酸锌（（CH3COO）2Zn，分析纯）和氢氧化钠（NaOH，分析纯）购自天津市科密欧化学试剂有限公司；乙酸钠（CH3COONa，色谱纯）和氢氧化钠（NaOH，色谱纯）购自美国Sigma-Aldrich 公司；半乳糖苷酶（8000 Units）、果聚糖酶混合物（20000 Units）购自爱尔兰Megezyme 公司；低聚半乳糖（纯度59.8%）、低聚果糖（纯度97.0%）购自北京量子高科集团有限公司；0.22 μm 尼龙滤膜和滤纸购自上海安谱实验科技股份有限公司；25 mL 聚丙烯注射器购自德国CNW公司；去离子水（Milli-Q超纯水仪制备）。

标准品： 2′-FL（纯度99.3%）、LNnT（纯度89.5%）购自中国计量科学研究院；婴幼儿配方奶粉（市售）。

1.2 分析条件

色谱柱： CarobPac PA1 及其保护柱。流动相： 流动相A 为125 mmol/L NaOH 水溶液； 流动相B 为250 mmol/L NaOH 水溶液； 流动相C 为（150 mmol/L NaOH+500 mmol/L NaAc 水溶液）/%； 流动相D 为纯水。流速1.5 mL/min，进样量25 μL； 洗脱条件如表1所示； 柱温为30 ℃。

表1 2种HMOs的梯度洗脱条件Table 1 Gradient elution conditions of two HMOs

1.3 标准工作溶液配制

1） 2′-FL（20 mg/mL）、LNnT（10 mg/mL）标准储备溶液： 分别称取20 mg的2′-FL 和10 mg的LNnT 标准品，用去离子水定容至1 mL，避光于4 ℃下保存，有效期30 d。2）再分别吸取适量上述2′-FL 和LNnT的标准储备液，用去离子水定容，配制成质量浓度为： 2′-FL（200 μg/mL）、LNnT（100 μg/mL）混合标准工作液-A和质量浓度为： 2′-FL（20 μg/mL）、LNnT（10 μg/mL）混合标准工作液-B，临用现配。3）分别吸取上述混合标准工作液-B体积0.500、1.000、2.000和3.500 mL和混合标准工作液-A体积0.500和0.750 mL于10 mL 容量瓶中，用水稀释并定容，配制成2′-FL 质量浓度为： 1.0、2.0、4.0，7.0、10.0 和15.0 μg/mL以及LNnT质量浓度为： 0.5、1.0、2.0、3.5、5.0和7.5 μg/mL的标准系列工作溶液。临用现配。

1.4 前处理方法

准确称取2 g（精确至0.0001 g）试样，用50 mL不超过70 ℃的温水充分溶解，冷却至室温后，加入沉淀剂Ⅰ（亚铁氰化钾150 g/L）溶液1 mL，摇匀，再加入沉淀剂Ⅱ（乙酸锌300 g/L）溶液1 mL，摇匀，再加入1 mol/L氢氧化钠溶液0.7 mL并摇匀，用纯水定容至100 mL容量瓶，静置20 min后，滤纸过滤，取滤液过0.22 μm聚醚砜水相针式滤器净化，取净化后的样液用纯水稀释适当倍数至进样瓶中，待测。

1.5 鉴别和测定

将试样溶液注入离子色谱仪中，记录色谱图。根据保留时间定性，记录峰面积，根据标准曲线得到待测液中各组分的质量浓度。

1.6 数据处理

液相模块控制、数据采集和定性定量分析为Chromeleon 7.2.10 ES 软件，实验数据的图形绘制和表格制作采用Excel 2019软件和WPS Office 2022软件。

2 结果与讨论

2.1 色谱柱的影响

CarboPac™ PA1 和CarboPac™ PA200 色谱柱是两种常用的糖分离柱，本文对该2 种色谱柱进行了比较，分别对2′-FL 和LNnT 辅料样液进样25 μL，结果如图1 示，虽然PA200 的色谱柱粒径更小，理应灵敏度和分离度更好，但通过谱图比较发现PA1色谱柱在峰形和响应上均好于PA200（经PA1色谱柱分离后2′-FL 和LNnT 均呈现瘦高状的峰，而PA200 分离后的峰形峰高不及PA1色谱柱且存在明显不对称的情况），且PA1对2种低聚糖的保留更强，分离度也更好，除固定相组成差异外这可能也与PA1色谱柱更大的柱容量有关，故选择PA1作为分离柱。

图1 2种色谱柱对（A）2′-FL和（B）LNnT的分离效果图Fig.1 The separation effect diagrams of two chromatographic columns for （A） 2′- FL and （B） LNnT

2.2 不同净化处理的影响

样液不同的净化方式对色谱柱寿命、检测器灵敏度以及谱图基线、色谱峰的位置和响应可能有不同程度的影响。本实验共对比了沉淀剂法、超滤离心法和pH调节法3种去除蛋白质的方式。沉淀剂法具体处理过程为1.4节中所述，相较之下，超滤离心法主要区别在于样品溶解冷却后不用沉淀剂Ⅰ和沉淀剂Ⅱ沉淀，而是定容到100 mL 后取样液用截留相对分子质量为1×104的超滤管在12000 r/min 条件下进行30 min 离心处理； pH 调节法则是参照国标方法GB 5009.89-2016《食品安全国家标准 食品中烟酸和烟酰胺的测定》，即在溶解和冷却后50 mL样液中用盐酸溶液将pH值先调节至1.7±0.1，静置2 min后再用1 mol/L 的NaOH 溶液将pH 值调节至4.5±0.1，考虑到离子色谱淋洗液为碱性，样液在静止1 min 后，再继续调至pH=7.0，定容后再在10 000 r/min条件下进行10 min离心，该法在实际应用时发现离心后样液浑浊，故后续未对该样液进行上机分析。通过对沉淀剂法和超滤离心法的谱图对比，发现于谱图2 min处超滤离心法有一响应很高的杂峰，虽然对2′-FL 和LNnT 无影响，但这说明沉淀剂法对样液中蛋白质的净化更为彻底，故采用沉淀剂法对样液进行净化。

图2 添加（A）半乳糖苷酶和（B）果聚糖酶的影响Fig.2 Effects of added （A） galactosidase and （B） fructosidase

2.3 酶解的影响

2.3.1 半乳糖苷酶的影响

半乳糖苷酶是一类能水解含半乳糖苷键物质的酶类，主要包括α-半乳糖苷酶和β-半乳糖苷酶，在前处理过程中引入半乳糖苷酶酶解可能有助于消除基质中乳糖、低聚半乳糖（GOS）等的干扰。选择一款含有2′-FL 和LNnT 的奶粉样品，通过设置半乳糖苷酶的对照试验以进行考察。对照实验组条件为： 移取充分溶解后的质量浓度为0.1 g/mL 的奶液0.2 mL 于10 mL 刻度试管，并添加50 μL 半乳糖苷酶以及1.8 mL 去离子水，60 ℃酶解2 h后，再用去离子水定容至10 mL并稀释10倍，同时过C18固相萃取小柱和0.22 μm 聚醚砜针式滤器（对照组以等量的去离子水替代半乳糖苷酶）。试验结果表明： 半乳糖苷酶可酶解2′-FL 峰左侧的乳糖，而对2′-FL 无明显酶解作用。这使得2′-FL 保留时间处基线高度明显降低，但对于LNnT，半乳糖苷酶已将其完全酶解。故对于同时测定乳粉中的2′-FL和LNnT的方法而言，在前处理过程中用添加半乳糖苷酶的方式消除干扰并不适用，该方式仅对单独测定乳粉中的2′-FL有效。

2.3.2 果聚糖酶的影响

针对由β-D-果糖组成的果聚糖，果聚糖酶能特异性催化水解其分子中的β-2，1 或β-2，6 糖苷键，此外，还可水解菊糖、蔗糖等。故在前处理过程中引入果聚糖酶酶解可能有助于消除基质中菊粉、低聚果糖（FOS）等的干扰。对照实验参照1.4小节进行。区别之处在于酶解过程需加入硼氢化钠和乙酸，且酶解温度和时间分别为40 ℃和30 min。实验结果表明，果聚糖酶对2′-FL和LNnT均无酶解作用，同时，发现LNnT 右侧的23.4 min 处的峰消失，推测其为果聚糖。故色谱条件优化过程中如发现果聚糖对LNnT峰有干扰，则可以在前处理过程中引入果聚糖酶酶解的方式消除干扰。添加半乳糖苷酶和果聚糖酶的效果见图2所示。

2.4 稀释倍数的影响

奶粉样液前处理和净化后虽然能去除大部分蛋白质等杂质，但是样液中可溶性的单糖、双糖等其他化合物浓度往往较高，离子强度较大，易导致色谱柱过载，出现基线偏高、分离度较差的情况，故需要对净化后的样液稀释合适的倍数以消除影响，同时保证2′-FL和LNnT有合适的响应。对同一处理后的样液用去离子水稀释不同的倍数进行考察，结果表明稀释倍数主要对2′-FL 峰和其左侧的干扰峰产生影响，在稀释5和10倍时，2′-FL 与基线未能完全分离，且峰的基线很高； 稀释20倍后基线明显降低，分离度基本可接受； 稀释50倍时，基线水平平稳，2′-FL峰与基线完全分离，但此时LNnT响应很低，可能已经不适合定量，故在兼顾2′-FL的分离度和LNnT的响应上，最终样液的稀释倍数在20～50倍内较为合适。

2.5 梯度洗脱条件的优化

合适的梯度条件是色谱分离和定量准确的关键。在前述实验中发现，未优化的洗脱条件下样品中LNnT的峰并不对称，有前伸趋势，故推测LNnT峰中有未分离杂质。通过逐步降低碱的比例对同一样液进行分离，结果如图3 所示，可知降低流动相中碱液的比例增加了LNnT 的保留，同时发现了LNnT 峰中确实有隐藏的杂质峰未能完全分离。故在此结论基础上继续降低碱相的比例，并调整梯度洗脱时间和流速等参数，最终得到表1中的洗脱条件，此条件下的色谱图如图4所示，可见优化后的梯度洗脱条件下2′-FL 和LNnT 都得到了很好的分离，且LNnT 峰形对称，此前在LNnT 右侧紧邻的某未知果聚糖峰也提前流出至左侧，这也将减小干扰峰对LNnT的影响。

图3 降低流动相中碱液的比例对LNnT分离的影响Fig.3 Reducing the effect of the proportion of lye in the mobile phase on LNnT separation

图4 优化后2′-FL和LNnT的分离效果Fig.4 Separation effect of 2′- FL and LNnT after optimization

2.6 线性范围

合理、合适的工作曲线范围设置是准确定量的前提。本实验对2′-FL 和LNnT 分别设置了7 个曲线点以考察质量浓度与峰面积之间的关系，并以每次减少一个范围上限点的方式考察的线性范围对工作曲线斜率、相关系数的影响，结果见图5，可知，对于2′-FL，在质量浓度范围0.788～157.5 μg/mL（曲线范围1）至范围0.788～36.0838 μg/mL（曲线范围4）过程中最小二乘法拟合出的斜率、决定系数呈增加趋势和截距呈减小趋势，这说明至少在曲线范围3的质量浓度设置上是偏高的，而曲线范围4的质量浓度设置是否合理还需进行考察； 对于LNnT，在质量浓度范围0.579～115.8 μg/mL（曲线范围1）至范围0.579～11.58 μg/mL（曲线范围4）过程中，斜率、决定系数（R2）和截距与2′-FL 同样的规律。故在曲线范围4 的基础上，在各自范围内增加了更多的点，最终确定2′-FL 和LNnT 的线性范围分别为1.0～15.0 和0.5～7.5 μg/mL，此时线性方程斜率、截距稳定，R2＞0.999，工作曲线见图6。

图5 （A） 2′-FL和（B） LNnT线性范围设置对工作曲线的影响Fig.5 The effect of setting the linear range of （A） 2'-FL and （B） LNnT on the working curve

图6 2′-FL和LNnT最终的线性范围以及线性方程Fig.6 The final linear range of 2'-FL and LNnT and the linear equation

2.7 干扰实验

GOS是一类由乳糖经β-1，4或β-1，6糖苷键形成的一般由3～8个半乳糖分子和1个葡萄糖残基组成的低聚糖，FOS 是一类由果糖以β-2，1或β-2，6糖苷键连接而成的末端有连接一个葡萄糖残基的果糖聚合物，一般聚合度为2～7，GOS和FOS均是多种聚合度不同、含量不一和结构各异的低聚糖混合物，而高效阴离子交换色谱安培检测法（HPAEC-PAD）的分离和测定是基于这些低聚糖之间羟基解离度的细微差异和糖分子结构中的羟基在金电极表面发生氧化还原反应时产生的电流实现检测，而婴幼儿配方奶粉中通常都有添加GOS和FOS，并期望达到具有类似于 HMOs 的益生元功效，故在处理前的样品中主动添加GOS和FOS辅料对2′-FL和LNnT的分离进行干扰，考察色谱方法的稳定性和适用性很有必要。如图7A 所示，通过3个不同水平添加GOS，发现GOS 主要有3 处色谱峰，GOS2和GOS3处在2′-FL 和LNnT峰之间，其中GOS3 的峰虽然未分离且紧邻LNnT，但是在优化后的色谱条件下与LNnT 依旧达到了基线分离，且在20 μg/mL的质量浓度下（相当于样品中含量2.0 g/100 g）响应较小，而大多数样品中GOS的添加量并不会超过该水平，故并不会对LNnT的积分定量造成影响。再由图7B所示，在3个不同水平添加FOS，发现FOS主要有2处色谱峰，FOS1出峰较早，FOS2则处于2′-FL和LNnT峰之间，虽然FOS2响应较大，但FOS2与2′-FL和LNnT相距较远，达到了完全基线分离，故也不会对积分定量过程造成影响。

图7 GOS（A）和FOS（B）对2′-FL和LNnT的分离影响Fig.7 Effect of GOS （A） and FOS （B） on the separation of 2'-FL and LNnT

2.8 方法验证

2.8.1 线性和精密度

线性结果见图6。对同一奶粉样品进行重复测定以验证方法精密度，对同一标准溶液进行连续测定以验证仪器精密度，根据GB/T 27417-2017《化学分析方法确认和验证指南》要求，除2'-FL质量分数方法精密度变异系数（CV）需＜2.0%外，其它项变异系数需满足＜2.7%，而由表2 精密度数据可知，变异系数均未超过标准要求。

表2 仪器精密度和方法精密度Table 2 Instrument precision and method precision

2.8.2 正确度

正确度采用加标回收方式进行验证。在奶粉样品中加入标准溶液，并混合均匀，然后按照本文所建立的分析方法进行检测实验，其中2′-FL 的3 个加标水平分别为1.2、0.8 和0.4 g/100 g，LNnT 的3 个加标水平分别为0.6、0.4 和0.2 g/100 g，每个加标水平进行3 次平行实验，测定结果见表3，可知2′-FL 回收率范围为95.97%～103.38%，平均回收率为99.60%； LNnT回收率范围为100.09%～104.01%，平均回收率为102.06%； 结果均满足GB/T 27417-2017《化学分析方法确认和验证指南》对回收率95%～105%的要求。

表3 加标回收结果Table 3 The result of spiked recovery

2.8.3 检出限和定量限

检出限（LOD）和定量限（LOQ）的验证采用“信噪比法”进行。即选择一空白样品，在前处理过程中加入接近于LOD和LOQ水平的2'-FL和LNnT参考物质，以目标分析物峰高为信号值，与一段噪音的平均高度值之比进行计算，当比值为3时，该目标分析物信号值对应的添加量为检出限； 当比值为10时，对应添加量为定量限。结果表明，2'-FL的LOD为1.5 mg/100 g、LOQ为5 mg/100 g，LNnT的LOD为3 mg/100 g、LOQ为10 mg/100 g。

3 结 论

本实验建立了婴幼儿配方奶粉中2′-FL和LNnT这2种母乳低聚糖的HPAEC-PAD，在方法建立过程中对诸多影响方法正确性、稳定性等的条件进行了考察。

在色谱柱对比中，虽然PA200 的色谱柱粒径更小，理论上灵敏度和分离度应更好，但实际发现PA1 色谱柱在峰形和响应上均好于PA200。在样液处理方式上对比了沉淀剂法、超滤离心法和pH 调节法3 种净化方式，结果为沉淀剂法对样液净化更为彻底，这对色谱柱、仪器的维护均是有利的。在酶解试验过程中，发现半乳糖苷酶对乳糖、LNnT 等有酶解作用，而乳糖的酶解反而有利于2′-FL 的测定，故该酶解方式仅对有需要单独测定乳粉中的2′-FL 时有效；而果糖苷酶对2′-FL 和LNnT 均无酶解作用，但是对LNnT 有一定的干扰，如色谱分离时发现果聚糖对LNnT 峰有干扰且优化色谱条件又难以分开时，则可以在前处理过程中引入果糖苷酶酶解的方式消除干扰。在梯度洗脱条件优化过程中，发现不断减低流动相中碱液的条件有利于保留和分离，故通过大量试验得到了一种相对较优的梯度条件，且该条件下2′-FL 和LNnT 分离度良好，在有低聚半乳糖和低聚果糖存在的样品中也不会干扰测定，故前处理中无需引入果糖苷酶进行酶解； 而线性范围考察过程中发现工作曲线点浓度设置范围较高时线性会变差、斜率也下降，反复试验后确定2′-FL 和LNnT 的最佳线性范围分别为1.0～15.0 和0.5～7.5 μg/mL。

2'-FL 和LNnT 是HMOs 中含量丰富的2 种寡糖，大约占总 HMOs 的35%，目前已有不少机构可以工业规模化生产，我国也已于2022 年发布了2'-FL 和LNnT 作为食品营养强化剂新品种的征求意见函，不少乳企将会在奶粉配方上迅速跟进，而本实验建立的HPAEC-PAD 将有助于婴配乳粉企业对2′-FL 和LNnT进行新产品的应用开发以及准确检测，也可为相关机构起草相关检测标准提供参考。