肝外胆管癌ANXA1和XIAP表达的临床病理研究

陈晓丽，王 霞，尚培中，李 伟，王 金，赵 臣

(1.中国人民解放军陆军第八十一集团军医院 普通外科，河北 张家口 075000；2.怀来世济医院 门诊部，河北 怀来 075400；3.中国人民解放军陆军第八十一集团军医院 检验病理科，河北 张家口 075000)

肝外胆管癌发病隐匿，出现临床症状时常已发生淋巴结和(或)神经组织转移，浸润性生长者常累及第一肝门血管及肝脏组织。由于对化疗、放疗均不敏感，目前有效的治疗方法仍然是根治性切除，但预后差，远期生存率较低，仅少数切缘阴性(R0)患者可获5年生存[1]。近年研究发现，肝外胆管癌发生发展存在多种肿瘤标记物的异常表达。膜联蛋白A1(annexin A1，ANXA1)具有钙依赖性磷脂结合功能，参与调控细胞增殖、分化及凋亡等，与多种肿瘤恶性发展相关[2]；X连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)属于凋亡抑制蛋白家族，对细胞凋亡起始及效应2个阶段均具有抑制功能[3]。我们应用免疫组织化学(immunohistochemistry，IHC)染色技术检测ANXA1和XIAP在肝外胆管癌及癌旁胆管组织中的表达，探讨ANXA1和XIAP与肝外胆管癌临床病理特征的相关性。

1 材料与方法

1.1 材料

选取2015-10-2020-12月中国人民解放军陆军第八十一集团军医院收治的58例肝外胆管癌患者的手术切除标本，其中男35例，女23例，男女比例为1.5∶1；年龄44～84岁，平均(62.8±6.2)岁；≤60岁21例，>60岁37例；癌灶大小≤1.5 cm 29例，>1.5 cm 29例；分化等级：高分化癌18例，中分化癌25例，低分化癌15例；TNM分期：Ⅰ期4例，Ⅱ期20例，Ⅲ期31例，Ⅳ期3例；有浸润转移(存在肝脏浸润或转移、神经侵犯、肝十二脂肠韧带及其周围淋巴结转移或脉管癌栓等)31例，无浸润转移27例。58例中随访满3年者42例，生存23例，死亡19例。癌旁对照30例切取距癌灶边缘超过5 mm、且病理证实无癌残留的胆管组织，高位胆管癌切取癌灶尾侧胆管，低位胆管癌切取癌灶头侧胆管。

纳入标准：①病理和IHC判定及分类明确的原发性肝外胆管癌；②临床资料齐全，超声、MSCT、MRI具有肝外胆管癌影像学特征；③术前未接受过化疗、放疗及其它抗癌治疗措施。排除标准：①肝外胆管腺癌之外的其他少见类型，如鳞癌、肉瘤等；②肝内胆管细胞癌；③原发性或转移性肝癌侵及肝门部胆管；④胆囊癌侵及肝外胆管；⑤胃、十二指肠腺癌侵及肝外胆管；⑥胰腺癌侵及肝外胆管；⑦并发其它恶性肿瘤的多源癌；⑧合并急性胆管炎或其它部位严重的炎性疾病；⑨并发其它严重系统性疾病。

1.2 研究方法

应用IHC染色EliVisionTM plus二步法检测肝外胆管癌组织及癌旁胆管组织中ANXA1和XIAP的表达。EliVision试剂盒、3，3′-二氨基联苯胺显色剂、鼠抗人ANXA1单克隆抗体、兔抗人XIAP单克隆抗体均购自于福州迈新生物技术开发有限公司。手术标本封蜡切片厚4 μm，采用微波仪修复抗原，IHC染色时选取与苏木素-伊红(HE)染色相邻切片，详细操作步骤见文献[4]。阳性对照采用ANXA1和XIAP阳性染色片，阴性对照采用磷酸盐缓冲液代替第一抗体。

1.3 判定标准

IHC染色呈棕黄色或棕褐色者为阳性颗粒，依据色度深浅和染色癌细胞占比2项指标判分定性：①色度深浅：无色、棕黄色、棕褐色分别判定为0分、1分、2分；②癌细胞占比≤5%、6%～30%、31%～69%、≥70%分别判定为0分、1分、2分、3分。根据①+②总分定性：0分、1～3分、4～5分，分别判定为阴性(-)、阳性(+)、强阳性(++)。

1.4 观察指标

①ANXA1和XIAP在肝外胆管癌组织及癌旁胆管组织中的表达部位及阳性率；②ANXA1和XIAP表达与患者性别、年龄、癌灶大小、分化等级、TNM分期、浸润转移及3年生存率7项临床病理特征的相关性；③肝外胆管癌组织ANXA1和XIAP表达的相关性。

1.5 统计学方法

运用SPSS 22.0分析数据。IHC染色判定为ANXA1和XIAP阳性组或阴性组例数采用n(%)表示，组间比较采用χ2检验，通过χ2值计算列联系数进行相关性分析。检验水准α=0.05，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 肝外胆管癌组织和癌旁胆管组织ANXA1和XIAP的表达比较

ANXA1和XIAP在肝外胆管癌组织和癌旁胆管组织主要表达于细胞质及细胞核。癌组织与癌旁胆管组织比较，ANXA1和XIAP阳性率差异有统计学意义(P<0.05)(表1)。

表1 肝外胆管癌组织及癌旁胆管组织ANXA1和XIAP表达比较 n(%)

2.2 肝外胆管癌临床病理特征与ANXA1和XIAP表达的关系

ANXA1和XIAP表达与性别、年龄无关(P>0.05)。在癌灶>1.5 cm、TNM(Ⅲ+Ⅳ)期、有浸润转移和3年内死亡患者中ANXA1和XIAP表达显著高于癌灶≤1.5 cm、TNM(Ⅰ+Ⅱ)期、无浸润转移和3年内生存患者(均P<0.05)。在(高+中)分化与低分化2组间，ANXA1阳性率比较差异无统计学意义P=0.054，XIAP阳性率比较差异有统计学意义P=0.030(表2)。

表2 肝外胆管癌临床病理特征与ANXA1和XIAP表达的关系 n(%)

2.3 肝外胆管癌组织ANXA1和XIAP表达的相关性

58例患者ANXA1和XIAP共阳性率为77.6%(45/58)，共阴性率为12.1%(7/58)，经相关性分析，ANXA1和XIAP在肝外胆管癌组织中表达呈正相关(r=0.54)(表3)。

3 讨 论

迄今尚未发现肝外胆管癌特异强的肿瘤标记物，其生物学特性与多种标记物的网状调控、协同表达或拮抗作用密切相关。研究发现，恶性肿瘤的发展转归与细胞凋亡密切相关，一旦后者发生紊乱，肿瘤细胞会不同程度增殖。ANXA1和XIAP均与癌细胞凋亡及癌灶浸润转移有关，是目前靶向治疗的研究热点[5-6]。我们分析了58例肝外胆管癌组织及30例癌旁胆管组织IHC染色结果，证实癌组织ANXA1和XIAP阳性率均显著高于癌旁胆管组织，表明两者表达状况有助于判断胆管良、恶性病变。

3.1 肝外胆管癌组织ANXA1表达与患者性别、年龄、癌灶大小、分化等级、TNM分期的关系

近年研究发现，ANXA1在多种肿瘤组织及血清中呈异常高表达[7-8]，其表达水平与恶性肿瘤生长、浸润、转移等生物学特性及患者预后显著相关[9-11]。樊又菠等[12]研究发现，胶质瘤内ANXA1的表达水平与动态增强磁共振灌注参数Ktrans值呈正相关，有助于鉴别高级别胶质瘤与低级别胶质瘤。有研究[13-16]报道ANXA1高表达与胆管癌灶大小、肿瘤分期、有无淋巴结转移等恶性发展行为显著相关，具有判定患者预后的临床实用价值。本研究通过对49例ANXA1阳性表达的肝外胆管癌进行分组对比，结果表明，ANXA1表达与男女性别、年龄大小无关(均P>0.05)。在癌灶>1.5 cm、TNM(Ⅲ+Ⅳ)期患者中ANXA1表达显著高于癌灶≤1.5 cm、TNM(Ⅰ+Ⅱ)期患者(均P<0.05)，表明ANXA1表达上调预示肝外胆管癌癌灶较大，临床及病理分期晚。在(高+中)分化与低分化2组间，ANXA1阳性率比较P值略大于0.05，可能与本研究样本较少有关，需进一步积累更多病例开展更大样本研究。

3.2 肝外胆管癌组织XIAP表达与患者性别、年龄、癌灶大小、分化等级、TNM分期的关系

近年研究表明，XIAP在多种肿瘤组织及血清中呈异常高表达[3，6，17]。下调XIAP基因表达，抑制NF-κB信号通路，可增强肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)诱导的多种癌细胞凋亡[18-19]。在胆囊癌和肝内胆管细胞癌也有类似的研究报道[20-21]。一些学者研究发现，XIAP蛋白与胆管癌的发生、发展密切相关，其高表达患者分化级别低，易发生淋巴结转移，总体生存率低于低表达或不表达患者[22-23]。本研究通过对47例XIAP阳性表达的肝外胆管癌进行分组对比，结果表明，XIAP表达在不同性别和年龄组(≤60岁与>60岁)之间表达的差异性均无统计学意义(均P>0.05)。在癌灶≤1.5 cm与>1.5 cm、(高+中)分化与低分化、TNM(Ⅰ+Ⅱ)期与(Ⅲ+Ⅳ)期的分组患者中，各组间阳性率差异均有统计学意义(均P<0.05)，表明XIAP高水平表达预示肝外胆管癌癌灶较大，恶性程度及病理分期高，临床进展快。

3.3 肝外胆管癌组织ANXA1和XIAP表达与转移、生存的关系

癌灶浸润转移影响患者生存质量和生存期，浸润转移潜能越大，病情发展越快。本研究中我们探讨了ANXA1和XIAP表达与肝外胆管癌浸润转移及生存期的关系，具有肝脏浸润或转移、神经侵犯、肝十二脂肠韧带及其周围淋巴结转移、脉管癌栓等浸润转移特征的患者，ANXA1和XIAP阳性率显著高于无上述浸润转移特征的患者，3年内死亡患者ANXA1和XIAP阳性率显著高于3年内生存患者，表明ANXA1和XIAP高表达的肝外胆管癌侵袭性强，生存期短。近年来，针对ANXA1阳性肿瘤干预其表达，为延缓浸润转移、提高化疗敏感性及免疫治疗效果、减少耐药性等提供了新途径[2，5-7]。Kwuntida等[12]认为，对ANXA1阳性胆管癌下调ANXA1基因表达或抑制ANXA1蛋白活性，可作为预防其转移的策略之一。另一方面，针对XIAP阳性肝外胆管癌的试验治疗也有较多报道，Clawson等[24]联合应用雷公藤甲素和TNF相关性凋亡诱导剂(TNF-related apoptosis inducing ligand，TRAIL)促进胆管癌细胞凋亡。Yin等[25]对XIAP高表达的胆管癌应用联苯二氟酮EF24[3，5-bis(2-flurobenzylidene)piperidin-4-one]抑制XIAP相关的NF-κB信号通路诱导胆管癌细胞凋亡，延缓癌灶生长。Wehrkamp等[26]研究发现，XIAP拮抗剂embelin可降低胆管癌细胞系XIAP表达。虽然迄今胆管癌的诊治效果仍不令人满意，但随着对其生物学特性的深入研究以及对胆管癌相关基因组和蛋白组信息网络数字化智能检测的不断丰富，个体化精准诊疗方案显然值得期待。

综上，ANXA1和XIAP高表达均与肝外胆管癌的恶性发展密切相关，且两者表达呈正相关，联合检测ANXA1和XIAP在癌组织及血清中的表达，对评估肝外胆管癌恶性程度、病情进展及预后、术后是否残留癌组织、动态观察临床疗效等均具有一定价值，相信针对两者的个体化分子精准治疗将提高胆管癌的综合诊治水平。