恩格列净对慢性间歇缺氧大鼠心房纤维化的影响及机制探讨*

刘永政 杨禹 王君 李瑞龄 袁梦 张跃 李广平

心房颤动(atrial fibrillation,AF)是临床常见的心律失常,其病理基质是心房纤维化。心房纤维化导致心房功能下降、传导异质性增加,从而引起AF。既往研究显示微小RNA-21(mi R-21)/软脂酰化磷蛋白-1(Spr y1)信号通路的异常激活及基质金属蛋白酶(matrix metallopr oteinase,MMP)的比例失衡可导致心房纤维化的发生[1－2]。

恩格列净(empagliflozin)是钠-葡萄糖协同转运体抑制剂(sodiu m-glucose cotransporter2 inhibitor,SGLT2i)之一,可以显著降低2型糖尿病患者心血管疾病死亡率、心力衰竭(简称心衰)住院率以及全因死亡率[3],并且其心血管获益独立于其降糖作用之外[4]。除此之外,动物实验还表明恩格列净可以改善高血压心力衰竭、心肌梗死、代谢综合征、肥胖合并2 型糖尿病导致的心脏纤维化[5－10]。慢性间歇缺氧可致心房组织发生明显的纤维化[1－2],但恩格列净对睡眠呼吸暂停低通气综合征(OSAHS)患者心房结构的影响尚未明确。

本研究拟建立慢性间歇缺氧大鼠OSAHS疾病模型,研究恩格列净对慢性间歇缺氧大鼠心房纤维化的影响以及对mi R-21、细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)、磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)、Spry1以及MMP-2、MMP-9的作用以探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 研究对象及分组 该实验得到天津医科大学伦理委员会批准(批号:T MUa MEC2016012)。取180～200g SD 雄性大鼠60只(北京华阜康生物科技股份有限公司),经过3天适应性饲养后,随机分为对照组(C组),慢性间歇缺氧组(CI H 组)和慢性间歇缺氧-恩格列净干预组(CI H-E组),每组20只。CI H 组以及CI H-E组接受为期40天的慢性间歇缺氧处理。每日接受间歇缺氧处理前,通过灌胃的方式给予CI H-E组自来水溶解的恩格列净(上海勃林格殷格翰药业有限公司,批号:国药准字J20171073)2 mg/kg。每7天测量体重以调整恩格列净给药量。同时给予C、CI H 组自来水灌胃。三组大鼠在恒温恒湿、光暗交替(12 h∶12 h)的环境里饲养,并给予充足的啮齿类动物食物及自来水。

1.2 慢性间歇缺氧处理 采用氧浓度控制箱(黑龙江迈沃德工贸有限公司,MA WORDE 大/小老鼠低氧实验箱GC-A )对大鼠进行慢性间歇缺氧处理。将CIH 组及CI H-E 组大鼠放入氧浓度控制箱,给予足够的食物与自来水。冲入氮气,使氧浓度逐渐下降至6.5%,维持5 min,随后冲入压缩空气直至氧浓度逐渐上升至18%,维持5 min。循环反复。第一天维持缺氧2 h,随后每日增加1 h,直至每天缺氧8 h。

1.3 一般数据采集 在完成40天慢性间歇缺氧程序后,三组同步进行一般数据采集。测量体重后将大鼠装进温暖的布袋中,露出鼠尾,待大鼠平静后,应用小动物无创检测仪(Softron T MC-213)测定鼠尾3次血压,取平均值。

1.4 心脏超声心动图检查 在完成40天慢性间歇缺氧程序后,三组同步进行进行心脏超声心动图检查。异氟烷(1～2 L/min)麻醉大鼠后,将其固定在动物平台上,左胸前区脱毛备皮,随后应用小动物超声仪(Philips 7500)测量如下数据:室间隔厚度,左室收缩末内径,左室舒张末内径,左房前后径,左室射血分数,肺动脉血流加速时间(PAT)。并依据公式:平均肺动脉压(mPAP)＝75－0.45×PAT 计算mPAP。

1.5 心房组织取材 以1～1.5 ml 10%戊巴比妥腹腔注射麻醉大鼠,待麻醉完全后自胸骨正中,逐层剪开皮肤、皮下组织、胸骨,分离组织,充分暴露心脏。以5 ml注射器刺入大鼠右心室取静脉血2 ml存于抗凝采血管中。取血后钳夹主动脉根部,迅速剪下大鼠心脏,于台式液中充分清洗心脏残余血液后置于滤纸上晾干称重,小心剪下心房组织。每组取5只大鼠的心房组织置于4%中性甲醛溶液中固定,常温保存。剩余15只大鼠的心房组织用锡纸包裹,经液氮预冷并转移至－80℃冰箱中保存备用。留取血液经4℃、4 000 r/min离心20 min,取上清液于2.5 ml EP 管,置于－80℃冰箱中保存备用。

1.6 组织病理学检查 应用Massion染色比较心房纤维化的程度并计算胶原分数。取甲醛溶液固定后的心房组织进行梯度脱水,随后进行石蜡包埋、切片(每片5μm),置于载玻片上,60℃烤干待用。应用改良Massion 三色染色液(Beijing SOLARBIO&TECHNOLOGY CO.,LTD),依据说明书步骤进行染色。随后光镜下观察心房组织的纤维化程度。应用i mage J软件进行胶原分析,去除心外膜、心内膜以及血管周围的结缔组织以外纤维化的结缔组织面积与组织总面积的比值,得到胶原分数。

1.7 靶mRNA 检测 应用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)法测定mi R-21、Spry1、ERK1/2、MMP-2、MMP-9的mRNA。应用RNA 提取试剂盒(Eastep R Super Total RNA Extraction Kit,LS1040,Shanghai Pro mega)按说明书提取大鼠心房组织总RNA,并应用Nanodrop 核算定量仪(Ther mo)测定RNA 的浓度。随后应用反转录试剂盒[Fast King RT Kit(Wit h g DAase,TIANGEN)],依据说明书配置20μL 反转录体系,应用Eppendorf梯度PCR 仪完成反转录以获取c DNA。将c DNA 放置于－20℃冰箱保存备用。取PCR用8联管,加入c DNA 及引物,配制25μL 反应体系。将PCR八联管放入ABI 7500定量PCR反应仪,依照各引物设定反应条件,测定目的基因CT 值,并计算目的基因表达量(2－△Ct法)。25μL 反转录体系包括:Double Distilled H2O 8.5μL,SYBR GREEN 荧光染料12.5 μL,For ward Pri mer 1μL,Reverse Pri mer 1μL,c DNA 2μL。GAPDH、Spry1、ERK1/2、MMP-2、MMP-9、mi R-21引物序列见表1。

表1 RT-q PCR 实验所用引物序列

1.8 靶蛋白检测 应用Wester n blot法测定并比较各靶蛋白的表达。将大鼠心房组织(约50 mg)与细胞裂解缓冲液(RIPA Lysis Buff er,CWBIO)1 ml、蛋白酶抑制剂(PMSF)10μL 及磷酸酶抑制(Roche)1/10 片置于EP 管中,加入锆珠8 粒,于Q24R 低温快速组织研磨匀浆仪(DHS)中4℃,6.5 m/s,震荡15 s,静置1 min,共研磨4 个循环。研磨结束后,将各样本对称放入高速离心机中,4℃、12 000 r/min,离心20 min,取上清200μL,加入50μl 5×蛋白上样缓冲液,100℃煮沸10 min。应用考马斯亮蓝比色法测定蛋白浓度。应用琼脂糖凝胶电泳将不同分子量蛋白分离,并转移到PVDF膜。PVDF 膜孵育下列抗体:β-actin (1∶4 000 Pr oteintech,USA),phospho-ERK1/2(1∶10 000 Abcam,USA),ERK1/2(1∶10 000 Abcam,USA),MMP-2(1∶5 000 Abcam,USA),MMP-9(1∶5 000 Abcam,USA),Spr y1 (1∶2 000 Cell Signaling Technology,USA)。随后孵育相应的二抗(鼠或兔1∶10 000)。将条带置于化学发光液(EZ ECL plco)2 min后于自动曝光仪中进行荧光显色。应用I magin J对显影的条带进行灰度分析。

1.9 统计学处理 应用SPSS 25进行数据统计分析。数据应用均数±标准差表示,计量资料组间比较,采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 三组一般情况以及心脏超声指标的比较与C组、CI H 组比较,CI H-E 组体重减轻,舒张压下降(P＜0.05),心脏重量有下降趋势,但尚未达到统计学差异。与C 组比较,CI H 组mPAP 升高;与CIH 组 比 较,CIH-E 组mPAP 下 降(P＜0.05)。其他一般情况以及心脏超声指标无差异(表2)。

表2 三组一般情况以及心脏超声指标比较

2.2 三组心房组织病理学的比较 与C 组比较,CI H 组心房肌组织纤维化程度加重,胶原分数升高[9.77%±1.88%(n＝10)vs 1.62%±0.75%(n＝10),P＜0.01];与CI H 组比较,CI H-E 组心房的纤维化程度减轻,胶原分数下降[6.77%±1.81%(n＝10)vs 9.77%±1.88%(n＝10),P＜0.05],但仍高于C组(P＜0.01)。详见图1。

图1 三组大鼠心房组织Masson染色(40×)

2.3 三组目标基因及蛋白的比较 与C 组比较,CI H 组mi R-21、ERK1/2、MMP-2、MMP-9的mRNA 明显升高,而Spr y1的mRNA 明显下降,相应的ERK1/2、p-ERK1/2、MMP-2、MMP-9 表 达 升高,Spr y1 表 达 下 降;与CI H 组 比 较,CI H-E 组mi RNA-21、ERK1/2、MMP-2、MMP-9 的mRNA明显下降,Spr y1的mRNA 升高,相应的ERK1/2、p-ERK1/2、MMP-2、MMP-9表达下降,Spry1 表达升高。与C 组 比 较,mi R-21、ERK1/2、MMP-9 的mRNA 明显升高,而Spry1、MMP-2 的mRNA 无明显变化。详见表3、4及图2。

图2 三组各蛋白表达

表3 三组mRNA 的比较

表4 三组各蛋白表达比较

3 讨论

笔者发现慢性间歇缺氧可以使大鼠的心房组织发生明显的纤维化,这与之前的研究是一致的[1－2,11]。而恩格列净可以改善慢性间歇缺氧导致的心房纤维化,且其机制可能是通过抑制mi R-21/ERK 信号通路以及MMPs途径发挥抗心房纤维化的作用。

经过40 天的缺氧程序之后,CI H-E 组体重较另外两组体重明显偏轻。由于慢性间歇缺氧期间CI H 及CI H-E两组大鼠进食均减少,而CIH 组大鼠体重无明显下降,所以可基本排除CI H-E 大鼠是因缺氧期间进食减少导致的体重下降。有研究表明恩格列净可通过降低体重以及减少脂肪合成降低心肌代谢的风险[12－13],但笔者的研究表明,尽管CIHE组体重较C 组、CIH 组明显下降,但三组大鼠的心脏重量没有差异,基本排除了由于体重的差异对大鼠心房纤维化的影响。

笔者的研究发现,与C 组及CI H 组相比,CHIE组大鼠的舒张压明显下降,而收缩压并没有明显下降。CI H-E组大鼠DBP明显下降的主要原因,结合恩格列净的药理学作用,推测是由于恩格列净增加大鼠的尿糖水平,渗透性利尿导致血容量下降,进而主要影响舒张压,但是本研究并未检测大鼠尿糖,具体机制需要试验进一步验证。

动物及细胞实验表明,SGLT2i可明显降低MMP-2以及MMP-9的水平[14]。笔者的研究发现恩格列净对MMP-2、MMP-9的影响与文献一致,可明显降低由间歇缺氧导致的大鼠心房组织中的MMP-2、MMP-9水平的升高。

本研究表明慢性间歇缺氧可以升高大鼠心房组织中的mi R-21 的mRNA 水平,并降低其下游靶基因Spr y1 的mRNA 水平。而Spry1 是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路中特异性抑制蛋白,可以抑制纤维化的关键信号通路MAPK/ERK1/2 通路。Spr y1 的下降进一步促进了心房组织纤维化。本实验中,恩格列净可以降低mi R-21 水平并升高Spr y1水平,进而抑制MAPK/ERK1/2通路,使ERK1/2、p-ERK1/2较CHI组大鼠明显下降,证明恩格列净可以通过抑制mi R-21/ERK1/2信号通路减轻慢性间歇缺氧大鼠的心房纤维化程度。

以往研究表明恩格列净可以降低2型糖尿病患者的心血管事件以及全因死亡率[3],且其心血管获益独立于降糖作用之外[4,15]。本研究提示尽管没有明确的证据表明恩格列净可直接影响心脏组织的分子靶点,但恩格列净可通过非SGLT2受体途径影响慢性间歇缺氧导致的心房肌的纤维化。

本研究的局限性:大鼠没有单独饲养,所以没有收集尿液以及与尿液有关糖尿、蛋白尿和尿钠排泄的信息。没有单独设置非缺氧大鼠恩格列净组以及利尿剂对照组。由于实验经费和材料有限,只选择了RT-q PCR 作为检测mi R-21 的手段,没有进行mi R-21 的Wester n blot检测;之前的实验表明p-ERK1/2 不适合做RT-qPCR 实验,故缺少p-ERK1/2 的RT-q PCR 数据。另外,没有检测其他的MMPs以及基质金属蛋白酶类组织抑制剂。