柴胡皂甙a减轻戊四氮诱发的皮质酮抑郁模型小鼠的急性癫痫发作：基于小胶质细胞介导的炎症反应

熊一凡，梁小珊，2，梁晓涛，李伟鹏，钱益啸，谢 炜，2

1南方医科大学中医药学院，广东 广州 510515；2南方医科大学南方医院中医科，广东 广州 510515；3广州市荔湾固生堂中医门诊部，广东广州510250

癫痫和抑郁症是常见的中枢神经系统疾病，这两种疾病常伴随认知和精神障碍等共病。癫痫以反复发作的癫痫发作为主要特征，而抑郁症则主要表现为持续的情绪低落、兴趣丧失和认知功能损害［1］。这两种疾病常常共存，抑郁症在癫痫患者中的发生率显著高于一般人群［2］。近年来，科研工作者对于癫痫与抑郁症之间的潜在联系给予了越来越多的关注。

有研究揭示了癫痫与抑郁之间可能存在的共同发病机制，如小胶质细胞介导的炎症反应［3］。然而，目前对于小胶质细胞如何在这两种疾病中起作用的理解仍然有限，且相关的干预研究主要集中在抗炎治疗上，对小胶质细胞的具体调控机制及其在癫痫伴随抑郁症状治疗中的作用尚未得到深入探讨［4-6］。此外，尽管一些研究已经尝试使用传统抗炎药物治疗癫痫伴随的抑郁症状，但这些治疗方法并未针对病理机制进行个体化优化，导致治疗效果不一，且可能伴有不良反应［7,8］。因此，探索新的疾病靶点和治疗策略，特别是基于小胶质细胞调控的方法，具有重要的临床意义。

柴胡皂甙a（SSa）是一种具有广泛药理作用的天然化合物，其化学结构独特，具有多个活性基团［9］。近年来研究表明，SSa在抗炎、抗氧化、抗癫痫和抗抑郁等方面均具有一定的作用［4-6,10,11］。特别是在治疗癫痫和抑郁症方面，SSa已经显示出了一定的疗效和潜力。然而，目前对于SSa在治疗癫痫伴随抑郁症状中的具体作用机制仍不清楚。

因此，本研究旨在探索SSa在抑郁伴随癫痫治疗中的作用，并特别关注其对小胶质细胞介导炎症反应的调节能力。通过建立抑郁伴随急性癫痫小鼠模型，并给予SSa干预，将评估其对症状改善和病理机制影响的有效性，以期能够发现新的治疗靶点，为临床实践提供科学依据，并为癫痫和抑郁症患者带来更多的治疗选择。

1 材料和方法

1.1 试剂及仪器

CORT检测试剂盒（北京普利莱基因技术有限公司）；皮质酮（Sigma）；戊四氮（上海达为科生物科技有限公司）；柴胡皂苷a（上海叶源生物有限公司）；生理盐水（万物生物科技有限公司）；4%多聚甲醛溶液（科隆化学品有限公司）；OCT包埋胶（Sakura）；HE 染色（BaSO，中国台湾）；尼氏染色（Beyotime，中国江苏）；Iba1 抗体（Abcam）；5417R 台式冷冻高速离心机（Bio.Tck）；Synergy-HT多功能酶标仪（上海亚荣生化仪器厂）。

1.2 实验动物及分组

SPF级C57BL/6J小鼠，雄性，5周龄（南方医科大学实验动物中心提供，合格证号: SYXK（粤）2021-0167）。经南方医科大学动物实验伦理委员会批准（许可证号：L2020038）。根据干预方式的不同，将小鼠分为5组：对照组（Control组）、癫痫组（Epilepsy 组）、抑郁＋癫痫组（CORT+Epilepsy 组）、癫痫组+Ssa 组（Epilepsy+Ssa 组）、抑郁＋癫痫+SSa 组（CORT+Epilepsy+SSa组），每组6只。

1.3 小鼠抑郁模型的构建

利用慢性口服糖皮质激素（CORT）构建小鼠抑郁模型，以每只小鼠消耗3～5 mL/d 水为准，每天配制新鲜的CORT 溶液，即0.2 g CORT溶于1 mL DMSO，100 μL加入200 mL饮用水中，进行口服给药，连续喂养3周。在3周的模型制作过程中，每日于同一时间段，观察并记录小鼠0～21 d的体质量和环境温度，并观察小鼠外观、自主活动、呼吸情况的变化。3周后利用旷场实验、十字高架实验、强迫游泳实验、糖水偏好实验评估抑郁相关指标，并通过ELISA实验检测血皮质酮含量来判断抑郁模型是否构建成功［12］。

1.4 构建抑郁伴发急性癫痫小鼠模型

利用腹腔注射单剂量的戊四氮（65 mg/kg）来诱发小鼠的急性癫痫。在给予戊四氮后观察30 min，记录小鼠癫痫发作时间、发作次数、发作等级及持续时间等，使用Racine 评分标准来评估小鼠癫痫的发作等级［13］，若未出现Ⅲ级及以上发作的小鼠，认定该小鼠造模失败，不再纳入后期的实验。针对抑郁+癫痫组小鼠，将两种造模方法联合起来，首先进行抑郁模型的构建，再诱发小鼠的急性癫痫。对于SSa治疗组别的小鼠，在注射戊四氮后的前7 d，分别给予腹腔内注射高剂量SSa 7.24 mg/kg。

1.5 实时荧光定量PCR

小鼠经戊巴比妥钠麻醉后，取海马组织，加入1 mL冷Trizol裂解溶液匀浆，离心后，取上清液加入200 μL氯仿。室温放置15 min，分层后再次混合液体，离心15 min，形成上清液（RNA水相）、中层液体（蛋白质相）和下层有机相。在新EP管中吸取300～500 μL上清液，并加入等体积的冷异丙醇，充分混合，室温下静置10 min，离心10 min，将白色沉淀回收。弃清液，离心数秒。加入1 mL 75%乙醇，颠倒均匀，使RNA沉淀物悬浮于乙醇中，离心10 min，弃上清液，将RNA沉淀物在室温下静置5～15 min，加入30～50 μL纯水。使用微量分光光度计检测RNA样本的纯度和浓度，根据Takara说明书将提取的总RNA逆转录成cDNA，制备RT-qPCR反应体系［14］。根据Roche PCR系统的协议运行PCR反应（表1）。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences for RT-qPCR

1.6 HE染色与Nissl染色

用冷PBS经心脏灌注后，完整取出小鼠大脑，将脑组织固定于4%多聚甲醛溶液48 h，石蜡包埋，切片，依次把大脑石蜡切片放进二甲苯Ⅰ20 min、Ⅱ20 min、无水酒精Ⅰ5 min、无水酒精Ⅱ5 min、75%酒精5 min，并用水洗涤；将切片进行HE染色与Nissl染色，立即用自来水冲洗10 min，在显微镜下观察以控制分化程度，然后，把切片放到新的二甲苯中透明10 min，再使用中性树胶封片［15］。最后，运用数字病理切片扫描仪进行图像采集。

1.7 免疫荧光染色

将冰冻切片从-20 ℃中取出，烘干，用组化笔将脑片组织圈好，将切片放在湿盒里面，滴加PBS浸泡3次，在0.5%TritonX-100通透液中室温内通透20 min，用含有5%山羊血清的PBS溶液在室温内封闭约1 h；加入适合的一抗稀释液，于4 ℃冰箱过夜；第2天回收一抗，用PBS冲洗3次，5 min/次；加入相应的二抗稀释液，在室温条件下，孵育约1 h，加入二抗稀释液后，避光；回收好二抗稀释液，用PBS将脑切片洗3次；再滴入含有抗荧光淬灭剂DAPI染液进行封片，最后使用病理荧光显微镜来观察切片并拍照［16］。

1.8 统计学分析

采用SPSS 26.0软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用Tukey法检验，若方差不齐则采用秩和检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠抑郁样行为的评估

与空白对照组相比，抑郁组小鼠体质量下降（P<0.01），糖水偏好率降低（P<0.05），强迫游泳的不动时间升高（P<0.05），旷场实验的总路程、中央格停留时间和路程均降低（P<0.001），高架实验中进入开放臂的次数和停留时间百分比均降低（P<0.05），抑郁组小鼠的血清CORT含量增加（P<0.05，图1），成功构建CORT诱导的抑郁症模型。

图1 小鼠抑郁样行为的评估Fig.1 Assessment of depressive-like behaviors in C57BL/6 mice.A: Body weight changes of the mice (n=6). B:Comparison of sugar and water preference(n=6).C:Forced swimming experiment(n=6).D-F:Comparison of total travel distance,central grid distance and central grid dwelling time in open field tests.G,H:Percentages of entries into the open arms and time spent in it in elevated plus maze test.I:Effect of CORT on central HPA axis in C57BL/6 mice.*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 vs Control.

图2 小鼠急性癫痫的发作情况Fig.2 Acute epileptic seizures induced by pentylenetetrazole in the mice in different groups.A:Latency of epileptic seizures (n=6). B: Percentages of different seizure grades. C: Number of epileptic seizures.D:Duration of epileptic seizures.*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001.

2.2 戊四氮诱发小鼠急性癫痫的发作情况

与Epilepsy组相比，CORT+Epilepsy组癫痫发作潜伏期明显缩短，发作等级、发作次数及发作持续时间明显增加（P<0.05）。两组均应用SSa干预后，发现SSa可延长癫痫发作潜伏期，减轻癫痫的发作等级（特别是Ⅳ级和Ⅴ级），减少癫痫的发作次数以及缩短癫痫的发作持续时间（P<0.05）。

2.3 小鼠海马CA1 和CA3 区神经元的损伤

HE染色和Nissl染色显示，Control组小鼠的海马CA1和CA3区神经元形态正常，排列整齐，无细胞损伤。相较之下，Epilepsy组小鼠的CA1和CA3区神经元结构紊乱，细胞肿胀破裂，胞核边聚、固缩、核仁消失，胞浆内Nissl 体表达减少（P<0.05）。与Epilepsy 组相比，CORT+Epilepsy组的Nissl体表达降低（P<0.05），Epilepsy+SSa组和CORT+Epilepsy+SSa组的Nissl体数量均增加（P<0.05，图3）。

图3 小鼠海马CA1 和CA3 区神经元细胞的损伤情况Fig.3 Injury of neuronal cells in the hippocampal CA1 and CA3 regions of the mice in different groups.A:HE and Nissl staining of the hippocampal CA1 and CA3 regions in each group(Original magnification:×200).B:Quantitative analysis of nissl bodies in hippocampal CA1 and CA3 regions.*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001.

2.4 小鼠海马CA1和CA3区小胶质细胞的活化

免疫荧光结果显示，与Control组相比，Epilepsy组海马CA1和CA3区小胶质细胞呈现活化状态，形态明显改变，呈现圆形或阿米巴状，细胞体积增大，Iba1阳性细胞数量增多。而CORT+Epilepsy组的小胶质细胞Iba1 阳性细胞数量更多。Epilepsy+SSa 组和CORT+Epilepsy+SSa组均观察到小胶质细胞Iba1阳性细胞数量减少（图4、5）。

图4 小鼠海马CA1区小胶质细胞免疫荧光情况Fig.4 Immunofluorescence staining of hippocampal CA1 astrocytes in different groups.A:Immunofluorescence staining in the hippocampal CA1 region in each group (×200). B: Quantitative analysis of Iba1-positive cells in the hippocampal CA1 region.*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001.

图5 小鼠海马CA3区小胶质细胞免疫荧光情况Fig.5 Immunofluorescence staining of the hippocampal CA3 astrocytes in different groups.A:Immunofluorescence staining in the hippocampal CA3 region in each group(×200).B:Quantitative analysis of Iba1-positive cells in the hippocampal CA3 region.*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001.

2.5 小鼠海马炎症因子的表达水平

与Control 组相比，Epilepsy 组的海马中IL-1β、IL-10、TNF-α、IFN-γ表达升高（P<0.001），而与Epilepsy组相比，CORT+Epilepsy组小鼠的海马中IL-1β、IL-10、TNF-α、IFN-γ的表达水平升高（P<0.05）。SSa治疗后，Epilepsy+SSa组和CORT+Epilepsy+SSa组小鼠海马的IL-1β、IL-10、TNF-α、IFN-γ表达水平均降低（P<0.05，图6）。

图6 小鼠海马炎症因子的表达水平Fig.6 Expression of inflammatory factors in the hippocampus in different groups.A-D:IL-1β,TNF-α,IFN-γ and IL-10 mRNA levels measured by RT-qPCR in the hippocampus in each group.＊*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001(n=6).

3 讨论

目前关于抑郁和癫痫共病的机制研究较少，可能与神经递质不平衡、炎症反应等有关［17,18］。据报道，约50%的重度抑郁症和颞叶癫痫患者体内均可发现下丘脑-垂体-肾上腺轴过度活跃，导致血清皮质酮（CORT）浓度升高［19］。故而，本实验选择了CORT诱导构建小鼠抑郁模型，合并戊四氮腹腔注射构建急性癫痫小鼠模型，用于研究抑郁和癫痫发作之间的关系，并给予SSa进行干预。本研究显示抑郁小鼠体质量下降、活动度及探索行为减少、糖水偏好率下降、血清中CORT水平升高。抑郁状态下，癫痫发作程度更加严重，小鼠海马CA1和CA3区神经元损伤更加明显，小胶质细胞活化程度以及炎症水平更高。这说明抑郁状态可能通过影响小胶质细胞介导的炎症反应激活，而增加癫痫的易感性及海马神经元损伤［20］。而经SSa治疗后，改善了癫痫的发作程度，减轻了海马神经元损伤，降低了小胶质细胞活化程度以及炎症水平。

临床研究发现，不仅癫痫病人患抑郁症的概率增加，而且，有抑郁病史的病人患癫痫的风险比普通人高4～7倍［21］。本研究从实验室角度，证实了这一临床现象，即抑郁状态可增加癫痫易感性。有研究数据表明，患有癫痫和抑郁症的患者均表现出海马结构或神经病理学异常，海马硬化是癫痫主要病理学特征，表现为CA区的神经元明显丢失，而原发性重度抑郁患者双侧海马体积约减少10%～20%，其程度与抑郁状态的持续时间有关［22,23］。与上述报道一致，本研究发现抑郁状态加重了癫痫海马CA区神经元的丢失，结构紊乱，细胞肿胀破裂，胞核边聚、固缩、核仁消失，胞浆内Nissl体减少等，从病理学水平进一步证明了抑郁影响癫痫发作。

作为大脑的免疫细胞，小胶质细胞是神经炎症反应的介导者［24］，而炎症反应是抑郁症和癫痫的主要致病机制之一。小胶质细胞活化是指在大脑受到刺激或损伤时，小胶质细胞数量和形态异常，并释放一系列细胞因子，从而引起一定程度的神经炎症［25,26］。据报道，抑郁症动物模型和重度抑郁患者的血清中促炎细胞因子IL-1β、TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-6等升高［27］；癫痫患者大脑的促炎细胞因子如IL-6、IL-1β、iNOS、TNF-α、IFN-γ的表达亦升高［28,29］。与上述报道一致，本研究发现，抑郁状态下癫痫发作的小鼠海马IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ等促炎因子表达升高，但也观察到抗炎因子IL-10表达水平也升高，考虑可能与大脑炎症水平升高的机体抗炎机制被同步激活有关。

本研究通过实验模型证实了抑郁状态与癫痫发作之间的密切关联，并进一步揭示了小胶质细胞介导的炎症反应在此过程中的核心作用。与现有临床研究相呼应，为理解癫痫和抑郁症共病的机制提供了新的实验室证据，并指出了当前治疗策略的挑战以及柴胡皂甙a的潜在治疗价值。抑郁和癫痫的共病现象不仅加剧了患者的疾病负担，也对现有的治疗策略提出了挑战。目前，针对癫痫和抑郁症的治疗主要依赖于独立的药物治疗和心理干预，但疗效往往有限，且可能伴有不良反应［30,31］。因此，探索能够同时针对两种疾病的有效治疗策略显得尤为重要［7,8］。本研究揭示了小胶质细胞介导的炎症反应在抑郁和癫痫共病中的关键作用。小胶质细胞作为大脑的免疫细胞，在神经炎症反应中发挥着核心作用。实验结果表明，抑郁状态可以加重癫痫发作的程度，并伴随小胶质细胞的活化和炎症水平的升高。进一步证实了炎症反应在癫痫和抑郁症共病中的重要作用。

柴胡皂甙a作为一种具有抗炎和神经保护作用的天然化合物，显示出了潜在的治疗价值。本研究发现，柴胡皂甙a能够改善抑郁状态下的癫痫发作程度，减轻海马神经元损伤，并降低小胶质细胞的活化程度和炎症水平。这些结果表明，柴胡皂甙a可能通过调节小胶质细胞和炎症反应来发挥抗癫痫和抗抑郁的作用。这为开发新的癫痫和抑郁症共病治疗药物提供了有力的实验室依据。

然而，本研究主要集中在短期内的干预效果上，对于柴胡皂甙a的长期治疗效果和机制尚缺乏深入的探讨。在未来的研究中，我们计划进行长期的动物实验来评估柴胡皂甙a对抑郁和癫痫共病的长期疗效，并进一步探讨其可能的作用机制。此外，考虑到药物的安全性和副作用对于临床应用的重要性，研究还需要对柴胡皂甙a 进行全面的毒性研究和临床试验来评估其安全性。未来的研究应关注柴胡皂甙a在不同类型的癫痫和抑郁模型中的作用、不同生物材料剂型的改造以及其对临床患者的影响。

综上所述，本研究发现了抑郁状态加重癫痫发作程度，增加小胶质细胞活化及炎症水平，而柴胡皂甙a可能通过调节小胶质细胞和炎症反应水平，发挥了抗癫痫的作用。这些发现不仅拓展了柴胡皂甙a治病的药理学机制，也为抗癫痫共病抑郁新药研发提供了新思路。在未来的研究中，我们将进一步探讨柴胡皂甙a的长期疗效和作用机制，以期为癫痫和抑郁症共病的治疗提供新的有效策略。