二甲双胍通过抑制铁死亡改善PM2.5导致的胎盘滋养细胞功能损伤

李淑贤，于淑平，穆亚铭，王 凯，刘 玉，张美华

1青岛大学附属山东省妇幼保健院，国家卫生健康委母胎医学重点实验室，山东 济南 250014；2山东第二医科大学，山东 潍坊261053

PM2.5 是大气颗粒物的一种，空气动力学直径≤2.5 μm，能够透过肺泡进入血液循环系统诱发呼吸道感染、心血管疾病、肺癌、免疫系统衰竭等多种全身性疾病，严重危害人体健康［1-5］。越来越多的证据证明，孕期PM2.5暴露可引起胎盘结构异常和功能改变，诱发早产、子痫前期、复发性流产等不良妊娠结局［6-9］。然而，关于PM2.5对妊娠结局和子代发育影响的研究目前多集中在流行病学领域，作用机制尚不明确。

研究发现，PM2.5可以通过肺泡壁进入循环血流并沉积在胎盘中，造成胎盘血栓形成、滋养细胞功能障碍，损坏胎盘功能，并对胎儿造成潜在风险［10,11］。此外，研究发现，PM2.5暴露引发胎盘滋养细胞炎症和氧化应激，功能受损明显［12］。铁死亡是近年提出的一种新型的调节性细胞死亡方式，主要依赖于细胞内铁和脂质活性氧（ROS）积累所引起的细胞死亡［13］。近些年的研究发现PM2.5暴露能够诱发细胞铁死亡造成肺损伤［14］；PM2.5也能够通过增加消化道细胞ROS产生、铁累积和脂质过氧化进而诱导铁死亡发生［15］。目前关于铁死亡在PM2.5诱发滋养细胞功能障碍中的研究尚少，阐明二者之间的关系有助于寻找有效的孕期保健策略。

二甲双胍是一种治疗2型糖尿病的药物，越来越多的实验研究和流行病学分析表明，它在免疫性炎症疾病、心血管疾病、癌症和衰老等方面产生健康益处，还可以减少多种细胞的氧化应激损伤［16,17］。研究发现，二甲双胍可以治疗或预防PM2.5 诱导的相关损伤［18］。另外二甲双胍虽然可以通过胎盘屏障，但不会对胎儿造成不良影响［19］，保证了其孕期应用的安全性。因此，研究二甲双胍是否能够逆转由PM2.5诱导的滋养层细胞功能损伤并探讨其机制具有重要的临床意义。

本研究通过构建PM2.5 染毒孕鼠模型，明确了PM2.5可通过诱发胎盘铁死亡导致不良妊娠结局；在体外PM2.5暴露人胎盘滋养细胞模型中，发现PM2.5可引发滋养细胞功能损伤并诱发铁死亡。同时，我们发现二甲双胍可以通过抑制滋养细胞铁死亡缓解PM2.5的毒性作用，这一发现将有助于阐明PM2.5导致不良妊娠结局的作用机制，为临床治疗和预防提供新的思路和靶点。

1 材料和方法

1.1 PM2.5颗粒

PM2.5采样时间为2020年10月～2021年4月，采样地点为山东省济南市天桥区泺口街道建材市场附近，该地区人口密集，交通拥挤，且周围设有化工厂和水泥厂。应用PM2.5石英纤维滤膜持续采样（雨雪天气除外）。采样后将滤膜切成1 cm2的碎片，加入100mL超纯水进行超声处理90 min，应用冷冻干燥机在-20 ℃条件下冷冻干燥过夜得到PM2.5颗粒，4 ℃条件下避光保存。通过扫描电镜观察PM2.5结构，并随机选取3～5个视野，利用X-射线能量色谱仪（EDS）分析PM2.5颗粒的尺寸和元素组成。后期实验将PM2.5颗粒溶解在PBS中制备成5 mg/mL悬浮液，并在超声作用下充分混合20 min。

1.2 细胞系

人绒毛膜滋养层细胞系HTR8/SVneo 购自美国ATCC（CRL-3271）。

1.3 主要药品与试剂

1640 培养基、胎牛血清（Invitrogen）；二甲双胍、GSH检测试剂盒、MDA检测试剂盒、SOD检测试剂盒、Edu细胞增殖检测试剂盒（上海碧云天生物科技有限公司）；铁离子检测试剂盒购（北京普利莱基因技术有限公司）；GPX4抗体（1∶1000）（Santa）；SLC7A11抗体（1∶1000）和β-actin抗体（1∶1000）（武汉三鹰生物技术有限公司）；基质胶、0.25%胰酶（BD）；划痕插件（ibidi）；DCFH-DA（Thermo）；Transwell 小室（Corning）；BCA蛋白检测试剂盒（北京索莱宝公司）。

1.4 方法

1.4.1 孕鼠PM2.5染毒模型构建及标本采集 选用8周龄左右的昆明小鼠雌鼠和9周龄左右的昆明小鼠雄鼠，于每天17:00将小鼠按照雌鼠∶雄鼠2∶1合笼过夜,温度控制在（18～22）℃，湿度控制在50%～60%。次日晨8:00检查雌鼠有无阴道栓，发现阴道栓之日即认定为妊娠第1天。挑选16只孕鼠随机分为2组，分为PBS对照组（n=8）、PM2.5暴露组（n=8）。参照小鼠的生理指标［20］，昆明小鼠8周时平均潮气量约为0.25 mL，每只小鼠的呼吸频率约为163次/min，则小鼠每天的总呼吸量=0.25 mL×163次/min×60 min×24 h≈0.0587 m3/d。据报道，2020年济南市孕妇PM2.5日均暴露量约为64 μg/m3［21］。因此，小鼠整个孕期（约20 d）的PM2.5总摄取量=0.0587 m3/d×64 μg/m3×20 d×100倍不确定因子≈7511 μg。其中100倍不确定因子=10倍种间差异×10倍个体差异［22,23］。因此我们称取7511 μg PM2.5颗粒，溶解于60 μL PBS缓冲液中，制备PM2.5悬液，分成等量的3份，分别在妊娠1.5、7.5、12.5 d（相当于人孕早期、孕中期、孕晚期）进行气管滴注。E15.5 d时将孕鼠安乐死，取出胎盘和胎鼠，称重并计数胎盘和胎鼠的质量和数量；取胎盘从中间切开一部分保存在4%多聚甲醛中，另一部分置液氮速冻后，-80 ℃条件保存备用。动物实验经山东省妇幼保健院伦理委员会批准（NO.2021-116），过程严格遵照SPF级实验动物管理条例进行。

1.4.2 细胞培养和PM2.5处理 人滋养层细胞系HTR8/Svneo使用含10%FBS、1%丙酮酸钠、1%青链霉素混合液（包括100 U/mL 青霉素和100 mg/mL 链霉素）的1640培养基于37 ℃、5%CO2恒温培养箱内进行培养。待细胞生长密度达到80%～90%融合时，经0.25%胰蛋白酶消化传代培养，进行后续实验。向培养基中加入100 μg/mL的PM2.5持续24 h构建PM2.5暴露细胞模型。同时参考以往文献分别添加10 μmol/LFerrostatin-1（Fer-1）和20 mmol/L 二甲双胍以检测二者对PM2.5引起的HTR8滋养细胞铁死亡的拯救作用［24,25］。实验分组如下：（1）铁死亡抑制剂Fer-1逆转PM25导致的细胞功能损伤分组：CON，Fer-1，PM2.5，PM2.5+Fer-1；（2）二甲双胍逆转PM25导致的细胞功能损伤分组：CON，二甲双胍，PM2.5，PM2.5+二甲双胍。

1.4.3 CCK8细胞增殖活性检测实验 传至96孔板的细胞与PM2.5培养24 h后，加入10 μL/孔的CCK-8溶液孵育2 h。应用酶标仪在450 nm处测量吸光度。

1.4.4 EDU实验 细胞以8×103/孔的密度接入96孔板，过夜贴壁后加入不同浓度的PM2.5 处理24 h，将1×EDU 工作溶液加入到细胞中，在37 ℃条件下下孵育2 h，EDU标记完细胞后去除培养基，随后加入4%的多聚甲醛室温固定15 min，用0.3%Triton 通透10 min。每孔加入0.5 mL Click反应溶液，在室温下在避光孵育10 min左右。用DAPI给细胞核染色，避光孵育10 min左右，使用高内涵对96孔板成像分析，评估96孔板内细胞的增殖情况。

1.4.5 划痕实验 将ibidi插件置于六孔板中，按7×104/孔的密度接种HTR8 细胞，培养过夜后用镊子轻轻取出插件，弃去细胞碎片，按照不同分组加入新的培养基培养24 h，显微镜下观察并应用Image J 软件进行分析。

1.4.6 Transwell实验 将Transwell插入物（8 μm孔径）置于24孔板中。上层小室铺60µL（1 mg/mL）的基质胶，于37 ℃放置1h。用无血清培养基调整细胞密度1×105/mL，取100 μL接种在上层小室中；下室加入600 μL含10%血清的完全培养基，在37℃条件下培养24 h。用棉签擦拭掉小室上层底部细胞，用4%多聚甲醛固定小室下层细胞，清洗后用0.1%结晶紫稀释液染色20 min，显微镜下观察侵袭到小室底部的细胞，随机选取5个视野拍照并计数。

1.4.7 管生成实验 将3×104细胞接种到涂有基质胶的96孔板中。孵育4 h后，将5 μmol/L钙黄绿素乙酰氧基甲酯（Calcein-AM），在37 ℃条件下孵育15 min。荧光显微镜观察管形成情况，应用ImageJ计算管长度。

1.4.8 GSH、MDA、铁离子含量检测和SOD 活性分析按 照GSH 试剂盒（MAK440）、SOD 测定试剂盒（S0103）、MDA测定试剂盒（S0131S）以及铁离子比色法检测试剂盒（E1042）检测方法，分析细胞中GSH、MDA、铁离子含量和SOD活性。

1.4.9 Western blotting实验 组织蛋白提取：取黄豆大小的胎盘组织置于预冷的研钵中，加入液氮研磨至粉末。加入500 μL含1%PMSF的RIPA，在冰上反应30 min，4 ℃条件下12 000g离心30 min，收集上清。细胞蛋白提取：细胞经预冷的PBS清洗后加入100 μL 1%PMSF 的RIPA，放置冰上反应30 min，4℃条件下12 000g离心30 min，收集上清。用BCA试剂盒检测蛋白（组织或细胞）含量。配制聚丙烯酰胺凝胶，蛋白变性后取约50 μg 进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳。将分离的蛋白转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，应用5%的脱脂奶粉室温封闭1 h；分别加入一抗GPX4（1∶1000）、SLC7A11（1∶1000）以及β-actin抗体（1∶1000）后，4℃摇床孵育过夜。应用TBST洗膜3次后加入HRP标记的二抗IgG（1∶2000），室温孵育1 h后TBST洗膜3次，加入增强化学发光（ECL）试剂在凝胶成像仪中进行显影。应用ImageJ软件分析蛋白条带灰度值，以目标蛋白与内参β-actin的比值作为各蛋白相对表达量。

1.5 统计学分析

应用GraphPad Prism 8.0 软件进行统计学分析。计量资料经正态性检验符合正态分布，用均数±标准差表示。两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用最小显著性差异法t检验。以P<0.05时认为差异有统计学意义。所有实验均重复至少3次。

2 结果

2.1 PM2.5的收集和理化性质检测

利用扫描电镜观察收集纯化到的PM2.5颗粒，结果显示PM2.5微粒呈现絮团状、球形、棒状以及不规则形状等多种结构形态（图1A）。利用能谱仪（EDS）分析随机采样的PM2.5元素组成，发现PM2.5微粒中的主要元素是O、Si和Al，同时也检测到其他元素如K、Na、Fe等。元素含量趋势：O>Si>Al>C>K>Na>S>Cl>Fe>Ni（图1B）。

图1 PM2.5颗粒理化性质检测Fig.1 Analysis of PM2.5 morphology and elemental composition. A: Scanning electron microscopic (SEM)images of PM2.5 particles.B:Analysis of PM2.5 elemental composition by SEM coupled with EDS.

2.2 PM2.5暴露导致小鼠胎盘结构受损并发生铁死亡

在妊娠1.5、7.5、12.5 d进行气管滴注，妊娠15.5 d对孕鼠实施安乐死并解剖，发现PM2.5暴露组中，胎鼠的质量和胎盘的质量显著降低（P<0.001），胎鼠的数目显著减少（P<0.01），且胎鼠死亡数量显著增多（P<0.001，图2A）。胎盘组织HE染色结果显示，相对于正常胎盘组织，PM2.5暴露组胎盘组织存在大量空泡结构，胎盘血管分布减少，红细胞数量显著减少（图2B）。胎盘组织免疫组化染色结果显示，PM2.5暴露降低了胎盘滋养细胞铁死亡相关蛋白GPX4的表达（图2C）。另一方面，胎盘组织匀浆经GSH、MDA、铁离子含量检测和SOD活性分析显示，PM2.5暴露组胎盘与正常胎盘组织相比，GSH减少（P<0.001），SOD活性显著下降（P<0.001），MDA 显著升高（P<0.001），铁离子蓄积（P<0.001，图2D～G）。胎盘组织Western blotting检测结果显示，铁死亡相关蛋白GPX4、SLC7A11 和正常对照相比差异显著（P<0.01，P<0.01，图2H、I）。

图2 PM2.5导致小鼠胎盘结构受损并发生铁死亡Fig.2 PM2.5 exposure of mice during pregnancy causes structural damage and ferroptosis in the placenta.A:Effect of PM2.5 on the fetus and placenta.B:HE staining of the placental tissues from mice with and without PM2.5 exposure (scale bar=100 μm). C: Immunofluorescence staining of CK7 (a trophoblastspecific marker protein) and GPX4 (the target protein) in the placental tissues in the two groups (DAPI:nucleus;scale bar=50 μm). D-G: GSH,SOD,MDA and Fe2+ concentrations in the placental tissues in the two groups detected by ELISA.H,I:Expressions of GPX4,SLC7A11 and β-actin in the placental tissues in the two groups detected by Western blotting.**P<0.01;***P<0.001.

2.3 PM2.5暴露导致滋养细胞功能损伤和铁死亡的发生

根据CCK8 结果得到PM2.5 暴露24 h 对HTR8/SVneo的半致死浓度（LD50）为120.1 μg/mL，我们选取100 μg/mL作为后续实验浓度（图3A）。EDU实验、划痕实验、Transwell以及管生成实验结果发现PM2.5暴露导致HTR8/SVneo细胞增殖、迁移、侵袭和成管能力降 低（P<0.01，P<0.01，P<0.01，P<0.05，图3B～I）。PM2.5暴露组细胞GSH减少（P<0.05），SOD活性显著下降（P<0.05），MDA显著升高（P<0.05），铁离子蓄积（P<0.05，图3J～M）。Western blotting检测结果显示，PM2.5暴露组细胞GPX4、SLC7A11表达均较正常组出现显著降低（P<0.01，P<0.01，图3N～O）。

图3 PM2.5暴露引发滋养细胞系HTR8/SVneo生物学功能损伤和铁死亡Fig.3 PM2.5 induces functional impairment and ferroptosis in HTR8/SVneo cells.A:Cell survival rate determined by CCK-8 assays(LD50=120.1 μg/mL).B:EDU(red)staining of proliferative HTR8/SVneo cells with the nuclei stained blue with DAPI(scale bar=100 μm).C:Quantitative analysis of cell proliferation rate.D:Wound healing assay at 0 h and 24 h in control and PM2.5-treated groups (scale bar=200 μm). E: Migration area in each group. F, G:Results of Transwell invasion assay of the cells(scale bar=50 μm).H,I:Results of tube formation assay of the cells(scale bar=100 μm).J-M:Concentrations of GSH,SOD,MDA and Fe2+in the cells measured by ELISA.N,O:Expressions of GPX4,SLC7A11 and β-actin detected by Western blotting.*P<0.05;**P<0.01.

2.4 铁死亡抑制剂Fer-1逆转PM2.5导致的滋养细胞功能损伤

铁死亡抑制剂Fer-1有效逆转了PM2.5暴露引发的滋养细胞GSH 浓度下降（P<0.01）、SOD 活性下降（P<0.05）、MDA 水平升高（P<0.05），铁离子聚集（P<0.05）等细胞铁死亡指标（图4A）。同时铁死亡抑制剂Fer-1 逆转了PM2.5 引发的GPX4 和SLC7A11 下降（P<0.001，P<0.01，图4B、C）。CCK8 实验结果显示，Fer-1逆转PM2.5导致的细胞增殖活性损伤（P<0.05，图4D）。另外划痕实验、Transwell以及管生成实验结果显示，铁死亡抑制剂Fer-1 挽救了PM2.5 暴露导致的HTR8/SVneo细胞迁移、侵袭和成管能力等生物学功能损害（P<0.05，P<0.01，P<0.01，图4E～J）。

图4 铁死亡抑制剂Fer-1逆转PM2.5导致的HTR8/SVneo生物学功能损伤Fig.4 Fer-1,a ferroptosis inhibitor,reverses PM2.5-induced impairment of HTR8/SVneo cell function.A: Concentrations of GSH,SOD,MDA and Fe2+in different groups.B,C:Expression levels of GPX4 and SLC7A11 in the cells detected by Western blotting.D:Proliferation activity of the cells detected by CCK8 assay.E,F:Results of wound healing assay of HTR8/SVneo cells at 0 and 24 h(scale bar=200 μm).G,H:Results of Transwell invasion assay(scale bar=50 μm).I,J:Results of tube formation assay of HTR8/SVneo cells(scale bar=100 μm).*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001.

2.5 二甲双胍逆转PM2.5导致的滋养细胞铁死亡和功能损伤

加入二甲双胍后能够逆转PM2.5 诱导的细胞内GSH 和SOD 水平的下降（P<0.01，P<0.01）以及MDA水平的增加和铁离子蓄积（P<0.001，P<0.001，图5A），并改善PM2.5作用引发的细胞内GPX4和SLC7A11下降（P<0.01，P<0.05，图5B、C）。细胞功能实验结果显示，添加二甲双胍可以逆转了PM2.5诱导的细胞增殖减弱（P<0.05）；迁移、侵袭能力受损（P<0.05，P<0.01）和成管能力减弱（P<0.05，图5D～K）。

3 讨论

研究表明，妊娠期间PM2.5暴露会引发子痫前期、早产、胎儿生长受限、死产等多种不良妊娠结局［26］，且暴露的PM2.5浓度越高，母亲及胎儿患病的风险就越大［27］。我们之前的研究分析了早产与空气污染物之间的关系，发现早产与空气污染物暴露存在很强的相关性［21］。为了深入探究大气微颗粒暴露对妊娠的影响，我们从山东济南提取PM2.5，利用气管内灌注法构建PM2.5染毒孕鼠模型。结果发现，PM2.5染毒引发孕鼠不良妊娠结局，如死胎率增加，胎儿数量减少，胎儿大小减小等。此外，我们发现PM2.5导致胎盘发育受损，迷路血管密度显著下降。因此提出假设，孕期PM2.5暴露可能通过诱发胎盘结构和功能障碍导致不良妊娠结局发生。

妊娠期间，胎盘是母胎营养物质交换的唯一器官，其功能与妊娠维持和胎儿生长密切相关［28］。研究发现，环芳烃、重金属、微塑料、全氟烷基物质和三氯乙烯等环境污染物可以在胎盘中累积并损害其功能，进而影响胎儿发育和存活［29］。PM2.5是多种大气污染物的混合物，由于体积小，可以穿透肺泡并通过血液循环沉积在胎盘。研究表明，孕期PM2.5暴露会增加胎盘早剥、炎症和高凝状态的机率，并伴有胎盘血管血栓形成和免疫细胞失衡［30］。本研究发现孕期PM2.5染毒，会导致小鼠胎盘滋养细胞铁死亡发生。为了进一步明确PM2.5损伤胎盘滋养细胞的机制，我们选择HTR8/Svneo滋养细胞系进行体外PM2.5细胞毒性实验。HTR8/Svneo细胞是通过转染编码SV40T抗原的cDNA结构获得永生化的人早孕胎盘体外培养细胞，在性质和表型上都非常接近绒毛外滋养细胞（EVT）［31,32］。体外细胞实验结果与在体实验结果相一致，PM2.5暴露导致HTR8/Svneo细胞铁死亡相关指标表达增加，而且细胞增殖、迁移、侵袭以及血管形成功能受损。应用铁死亡机制剂能够挽救PM2.5对滋养细胞的功能损害。这些结果证实PM2.5可能通过诱发滋养细胞铁死亡导致胎盘结构和功能障碍。

铁死亡是一种非典型的细胞死亡方式，与细胞凋亡、坏死、自噬和焦亡等死亡方式在形态学和生物化学等方面存在明显差异。近些年，铁死亡在PE、RSA、PB以及GDM等妊娠相关疾病中都有研究报道［33-35］，是目前妊娠相关疾病发病机制的重要研究方向。铁死亡的调节机制主要涉及脂质代谢、氨基酸代谢和铁代谢等方面。GPX4是铁死亡的中心调节分子。当GPX4活性受到抑制时，细胞氧化还原稳态被打乱，ROS升高，诱发细胞铁死亡发生［36］。研究发现，抑制GPX4能够导致人胎盘滋养细胞铁死亡发生［37］。谷胱甘肽（GSH）是GPX4的辅因子，也是体内重要的还原剂，参与体内重要的细胞代谢活动，在铁死亡发生中起负向调控作用。SLC7A11可导入胱氨酸进行谷胱甘肽生物合成和抗氧化防御，过表达可抑制细胞铁死亡发生。因此，GPX4和SLC7A11活性降低或者GSH耗竭，均会导致细胞铁死亡，是铁死亡的核心指标。另一方面，铁死亡发生与细胞内的铁稳态失衡相关。细胞中的铁主要以Fe2+和Fe3+两种形态存在，当GSH耗竭、GPX4活性下降甚至失活时，有毒的脂质氧化物与Fe2+发生芬顿反应，诱发脂质过氧化，促使机体产生大量羟自由基和ROS，引起细胞发生铁死亡［38］。我们通过体内外研究发现，PM2.5暴露引发小鼠胎盘组织和滋养细胞系脂质氢过氧化物分解物MDA显著升高，铁离子蓄积，GSH减少，SOD活性显著下降，同时GPX4、SLC7A11和正常对照相比差异显著。因此我们提出PM2.5暴露引发滋养细胞铁死亡发生，可能是PM2.5造成不良妊娠结局的重要机制。

目前，治疗PM2.5引起的细胞或组织损伤的研究还处于起步阶段。研究发现，罗格列酮能够减少PM2.5对A549细胞的毒性作用［39］，褪黑激素通过减少肺上皮细胞中的铁蓄积降低PM2.5诱导的肺损伤［18］。此外，一些传统的中药经研究发现可以保护肺和心血管系统免受PM2.5的损害［40,41］。我们创新性地发现二甲双胍可以通过抑制铁死亡挽救HTR8/Svneo滋养细胞功能，可能改善PM2.5暴露引起的不良妊娠结局。二甲双胍是天然产物半乳糖的合成衍生物，尚未经过特殊工程处理。研究发现，二甲双胍对PM2.5诱导的血栓形成和胰岛素抵抗有保护作用，并能减轻内毒素诱导的急性肺损伤和横向主动脉收缩性心力衰竭［18］。

我们的实验结果表明，二甲双胍应用不仅降低了PM2.5暴露引起的滋养细胞铁死亡损伤，而且还挽救了滋养细胞的功能障碍。在未来的研究中，我们将结合体内实验进一步探究二甲双胍在PM2.5 暴露导致的不良妊娠结局中的作用，为临床应用提供数据支持和新的途径。