黄蒲通窍胶囊改善Wilson 病铜负荷大鼠的认知损害：基于抑制内质网应激介导的凋亡途径

张笑颜，王 谢，王 杰，邵 楠，蔡 标，谢道俊

安徽中医药大学1中西医结合学院，2第一临床医学院，3护理学院，安徽 合肥 230012；4安徽中医药大学第一附属医院脑病中心，安徽 合肥230031

认知损害是Wilson病（WD）的常见并发症，其症状包括记忆缺陷和执行功能受损［1-3］。目前普遍认为，ATP7B基因突变引起的铜代谢异常导致铜在大脑中过度积累，是WD认知功能障碍的主要原因［4,5］。作为一种罕见的遗传疾病，一旦患病，将给社会和家庭带来严重的负担。WD认知损害的病理机制复杂，目前尚未阐明。在所有病理因素中，神经元凋亡被认为是WD认知损害发展的一个重要过程。据报道，高铜环境可导致大鼠突触敏感性降低，导致学习记忆障碍［6-8］，其原因可能与氧化应激和炎症诱导的神经元死亡有关［9-11］。黄蒲通窍胶囊（HPTQ）是安徽中医药大学第一附属医院的院内制剂，对认知障碍具有显著疗效。课题组前期研究发现，HPTQ可以通过调节钙信号通路降低磷酸化Tau表达水平及激活CREB/BDNF/TrkB信号通路抑制海马神经元凋亡来改善大鼠的认知损害［12,13］。上述研究证实HPTQ具有神经保护能力，但其对WD认知损害的潜在疗效和作用机制仍有待进一步探索。

内质网（ER）是真核细胞中蛋白质合成、加工和折叠的关键场所。研究发现，内质网应激（ERS）介导的神经元凋亡是认知障碍发展的内在因素［14］，高铜环境会诱导错误折叠的蛋白质积累及ERS的发生，并触发葡萄糖调节蛋白78（GRP78）异常升高，激活CHOP蛋白及下游的caspase-12途径，最终介导细胞凋亡的发生［15-17］。课题组前期研究发现，HPTQ能抑制Aβ25-35诱导的原代培养海马神经元阿尔茨海默病(AD)细胞模型的凋亡［18］；动物实验证实，GRP78在AD模型大鼠海马中的表达增加，并与神经元凋亡数量呈正相关［19］。但是，HPTQ能否通过调控ERS介导的凋亡途径抑制神经元凋亡进而改善WD认知损害尚未见报道。

为此，本研究通过铜负荷饮食构建WD铜负荷大鼠模型，观察HPTQ 对模型大鼠认知功能的影响，并从ERS介导的凋亡角度探讨其可能的作用机制，旨在为HPTQ治疗WD认知损害提供科学的实验依据。

1 材料和方法

1.1 动物

60只3月龄SPF级雄性SD大鼠，体质量180～200 g，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，许可证号SCXK（鲁）20190003。将所有大鼠置于动物笼中，4只/笼。养殖环境：相对湿度（50±10）%，室温22±2 ℃，12 h光照/12 h暗循环调节。实验方案经安徽中医药大学实验动物伦理委员会批准（No.AHUCM-rats-2022052）。

1.2 药物

黄蒲通窍胶囊（安徽中医药大学第一附属医院，皖药制字Z20080006）；硫酸铜（CuSO4·5H2O），含量≥99%（上海国药集团化学试剂有限公司）；青霉胺片（上海信谊药厂有限公司，国药准字H31022286）。

1.3 试剂

铜离子（Cu）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）；BCA 蛋白定量试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；GRP78、CHOP、caspase-12、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3、β-actin抗体（Affinity Bioscience）；山羊抗兔二抗（Abbkine）；ECL 化学发 光试剂 盒（Biosharp）；TUNEL检测试剂盒、苏木素染液（ebiogo）；PrimeScript™RT试剂盒（TAKARA）；Novostart SYBR qPCR SuperMix Plu荧光染料（novoprotein）。

1.4 仪器

Morris水迷宫分析系统（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；多功能酶标仪（上海沛欧分析仪器有限公司）；超薄切片机（德国徕卡公司）；数码相机（德国蒙斯特公司）；电泳仪（Bio-Rad）；全自动化学发光图像分析系统（上海天能生命科学有限公司，型号：Tanon 5200）。

1.5 造模、分组与给药

60只SD大鼠按随机数字表法均分为对照组、模型组、黄蒲通窍低剂量组（HPTQ-L）、黄蒲通窍中剂量组（HPTQ-M）、黄蒲通窍高剂量组（HPTQ-H）、青霉胺组（PCA）；各给药组给予含铜（1 g/kg）饲料和含铜（0.185%）水造模12周［20］；参考课题组前期研究［21,22］，第9周起，给药组每日分别给予不同剂量HPTQ(0.47、1.41、4.23 g/kg)及PCA（0.09 g/kg）灌胃，对照组每日给予等量生理盐水灌胃。

1.6 大鼠肝铜、24 h尿铜水平检测

取新鲜肝脏组织，洗净匀浆，离心后取上清；或取24 h尿液，避光孵育，按说明书操作，在酶标仪600 nm波长处记录光度值。

1.7 Morris水迷宫

将圆形泳池均分为4个区域，逃生平台置于目标象限中间。前4天，大鼠在不同的象限出发进行空间训练。第5天，将大鼠从对侧象限游到逃生平台的时间记录为逃避潜伏期。第6天，取下平台，记录大鼠从对侧象限起自由游动90 s内穿越平台次数。

1.8 HE染色

4%多聚甲醛固定脑组织，石蜡包埋切片，脱蜡和脱水后，进行HE染色，在光学显微镜下观察海马CA1区神经元形态学变化。

1.9 TUNEL染色

石蜡切片在脱蜡和再水化后，用蛋白酶K在37 ℃下孵育，然后用PBS漂洗3次。TUNEL检测试剂盒用于染色。使用抗荧光猝灭密封剂密封薄膜，并通过数字切片扫描仪扫描荧光切片。

1.10 免疫荧光染色

石蜡切片脱蜡后透膜5 min，室温封闭1 h，在含一抗GRP78（1∶100）的PBST溶液中4 ℃孵育过夜。使用荧光二抗37 ℃避光孵育30 min，清洗后用抗荧光淬灭剂（含DAPI）封片，使用数字切片扫描仪扫描荧光切片。

1.11 Western blot 检测海 马组织GRP78、CHOP、caspase-12、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3 蛋白表达

提取新鲜海马组织总蛋白，使用BCA法测定蛋白浓度。10%、12%SDS-PAGE电泳分离总蛋白，转膜（120V、1.5 h）后快速封闭20 min，加入兔抗大鼠一抗GRP78（1∶1000）、CHOP（1∶1000）、caspase-12（1∶1000）、cleaved caspase-9（1∶1000）、cleaved caspase-3（1∶1000），4 ℃孵育过夜，洗膜后使用山羊抗兔IgG（1∶20 000）孵育2 h，洗膜后加入ECL曝光并拍照，分析各蛋白相对表达量。

1.12 RT-qPCR检测海马组织GRP78、CHOP、caspase-12、caspase-9、caspase-3基因表达

提取大鼠海马组织总RNA，采用PrimeScript™RT试剂盒将RNA 逆转录为模板cDNA。采用Novostart SYBR qPCR SuperMix Plu进行qPCR 反应。反应条件设置为95 ℃预变性1 min，95 ℃变性20 s，60 ℃退火1 min，40 个循环，收集荧光信号，结果采用2-ΔΔCT计算mRNA 的相对表达量。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司设计合成，引物序列见表1。

表1 RT-qPCR引物序列Tab.1 Primer sequences for RT-qPCR

1.13 统计学方法

SPSS 26.0软件用于数据分析，计量资料用均数±标准差表示。多组间样本比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HPTQ对各组大鼠肝铜、24 h尿铜水平的影响

与对照组比较，模型组大鼠肝铜、24 h尿铜水平明显升高（P<0.01）；与模型组比较，HPTQ-L、HPTQ-M、HPTQ-H 和PCA 大鼠肝铜水平明显降低（P<0.01），24 h尿铜水平明显升高（P<0.01，图1）。

图1 各组大鼠肝铜、24 h尿铜水平比较Fig.1 Liver and 24-h urinary copper levels in each group(Mean±SD,n=6).**P<0.01 vs Control group;##P<0.01 vs Model group.

2.2 HPTQ对各组大鼠学习记忆能力的影响

与对照组比较，模型组大鼠逃避潜伏期明显延长（P<0.01），穿越平台次数明显减少（P<0.01）。与模型组比较，HPTQ-L、HPTQ-M、HPTQ-H和PCA组大鼠逃避潜伏期明显缩短（P<0.05或P<0.01），HPTQ-M和PCA组大鼠穿越平台次数明显增多（P<0.01，图2）。

图2 各组大鼠学习记忆能力比较Fig.2 Learning and memory abilities of the rats in each group (Mean±SD, n=6).**P<0.01 vs Control group;#P<0.05,##P<0.01 vs Model group.

2.3 HPTQ对各组大鼠海马组织CA1区病理变化的影响

对照组大鼠神经细胞结构完整，形态规则，细胞核大而圆，染色均匀。模型组大鼠细胞结构疏松，排列紊乱，细胞质深染，核边界不清，神经元变性和萎缩。各治疗组大鼠海马组织CA1区神经元的病理变化均有不同程度的减少，其中HPTQ-M和PCA组改善效果最为显著（图3）。

2.4 HPTQ对各组大鼠海马CA1区凋亡水平的影响

与对照组比较，模型组大鼠TUNEL阳性神经元数量明显增加（P<0.01，图4）；与模型组比较，HPTQ-L、HPTQ-M、HPTQ-H和PCA大鼠TUNEL阳性神经元数量明显减少（P<0.01，图4）。

图4 各组大鼠神经元凋亡率比较Fig.4 Apoptosis of the neurons in hippocampal CA1 region in each group(Mean±SD,n=3).**P<0.01 vs Control group;##P<0.01 vs Model group.

2.5 HPTQ对各组大鼠海马CA1区GRP78荧光表达的影响

与对照组比较，模型组大鼠海马CA1区GRP78绿色荧光明显增加。与模型组比较，HPTQ-M和PCA组大鼠海马CA1区GRP78绿色荧光明显减少（P<0.01，图5）。

图5 各组大鼠海马GRP78荧光表达比较Fig.5 Fluorescence intensity of GRP78 in the hippocampus in each group(Mean±SD,n=3).**P<0.01 vs Control group;#P<0.05,##P<0.01 vs Model group.

2.6 HPTQ 对各组大鼠海马组 织GRP78、CHOP、caspase-12、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3蛋白表达的影响

与对照组比较，模型组大鼠海马组织GRP78、CHOP、caspase-12、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3蛋白表达水平明显升高（P<0.01）；与模型组比较，HPTQ-M、PCA大鼠海马组织GRP78、CHOP、caspase-12、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3蛋白表达水平明显降低（P<0.05或P<0.01，图6）。

图6 各组大鼠海马ERS介导的凋亡途径关键蛋白、基因表达水平比较Fig.6 Expressions of key genes at the mRNA and protein levels in ERS-mediated apoptosis pathway in the hippocampus in each group of rats(Mean±SD,n=3).**P<0.01 vs Control group;#P<0.05,##P<0.01 vs Model group.

2.7 HPTQ 对各组大鼠海马组织GRP78、CHOP、caspase-12、caspase-9、caspase-3基因表达的影响

与对照组比较，模型组大鼠海马组织GRP78、CHOP、caspase-12、caspase-9、caspase-3基因表达水平明显升高（P<0.01）；与模型组比较，HPTQ-M、PCA大鼠海马组织GRP78、CHOP、caspase-12、caspase-9、caspase-3基因表达水平明显降低（P<0.01，图6）。

3 讨论

神经元凋亡是认知障碍的病理特征。铜是维持人体正常生理功能的重要元素之一，但过量的铜可能具有神经毒性。许多研究者关注了过量铜对认知功能的损害，饮用含铜（CuSO4·5H2O）水会引起小鼠神经元丢失，体内注射CuCl2会导致大鼠海马体铜过载，影响大鼠的学习记忆能力［8,23］。在WD中，由于ATP7B功能丧失引起的铜排泄障碍，则会导致过量铜在体内堆积，给肝、脑、肾等器官造成巨大伤害［24］。铜负荷大鼠是模拟WD的经典动物模型，能很好地反映WD引起的肝、脑等器官的病理变化。既往研究表明，WD铜负荷大鼠模型出现了肝铜、24 h尿铜水平升高，以及空间学习和记忆障碍，表明该模型能在一定程度上模拟WD认知障碍的疾病特征［9,20］。为了证实铜对大鼠学习记忆的影响及其可能的机制，我们首先建立了WD铜负荷大鼠模型。结果表明，WD铜负荷大鼠肝铜和24 h尿铜水平升高，表明该动物模型已成功制备。此外，Morris水迷宫实验显示模型组大鼠逃避潜伏期明显延长，穿越平台次数显著减少，表明WD铜负荷大鼠模型出现了认知损害现象。

中医学认为，本病病机属先天不足，脾肾气虚，脑髓失养，加之铜毒内侵，痰瘀互结，上阻清窍，治法当为益气补肾，化痰祛瘀［25］。HPTQ由人参、大黄、石菖蒲、益智仁、川芎、何首乌6味中药组成。课题组前期研究发现，HPTQ能改善AD模型大鼠的认知功能，其活性成分大黄酚对改善WD认知损害有积极作用［21,22］。本研究结果表明，HPTQ能降低模型组大鼠肝铜水平，提高24 h尿铜水平，缩短逃避潜伏期，增加穿越平台次数，改善海马神经元损伤，说明HPTQ可促进模型组大鼠体内铜的排出，改善认知损害，提示HPTQ对WD铜负荷大鼠模型具有神经保护作用。

ERS诱导的细胞凋亡是一种新型的细胞凋亡方式，研究发现铜过载［26,27］。此外，课题组在之前的研究中也发现ERS的激活会引起大鼠神经元丢失并导致学习、记忆功能的损伤［28］。GRP78被认为是ERS发生的标志蛋白，在ERS的早期会迅速增加［29］。随后，伴随未折叠蛋白反应的延长会引起CHOP蛋白的上调及caspase-12、caspase-9、caspase-3激活，并启动半胱天冬酶家族的经典细胞凋亡途径，致使细胞凋亡［30,31］。

本研究结果显示，模型组大鼠海马CA1区TUNEL阳性神经元数量及GRP78绿色荧光明显增加，而HPTQ显著减少了TUNEL阳性神经元数量及GRP78绿色荧光的表达，其中以HPTQ-M效果最好。基于此，本研究选择HPTQ-M 作为最适给药浓度，进行机制探讨。Western blot结果显示，HPTQ显著降低了模型组大鼠海马组织ERS 介导的凋亡途径中关键靶点GRP78、CHOP、caspase-12、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3的蛋白表达水平；RT-qPCR结果也显示，HPTQ显著降低了模型组大鼠海马组织GRP78、CHOP、caspase-12、caspase-9、caspase-3的基因表达水平。因此，本研究表明HPTQ 可以逆转WD 铜负荷大鼠模型海马组织中ERS介导的神经元凋亡。

综上所述，本研究通过体内实验探究HPTQ对WD铜负荷大鼠模型的神经保护作用及调控机制。结果显示，HPTQ能够通过抑制ERS介导的凋亡途径减少大鼠神经元凋亡，改善WD铜负荷大鼠模型认知损害。本研究初步揭示了HPTQ对WD认知损害的治疗作用，为HPTQ的临床治疗提供了理论支持。