酶解改性技术在提高核桃蛋白粉溶解性中的研究

◎ 卢宝川

（广东一家人食品有限公司，广东 汕头 515000）

核桃作为高蛋白、高脂肪的食物，其具有较高的营养价值、经济价值以及药用价值[1]。在食用方面，核桃可以直接食用或者作为辅料加入其他营养产品中，增加营养品的功能性。但在深加工方面，现有的研究多集中于核桃油的制备方面，而对核桃蛋白粉的研究较少，降低了核桃的附加值[2]。

核桃蛋白主要包括清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白以及谷蛋白，蛋白质含量高达24%，且富含人体必需的氨基酸[3]，但谷蛋白不溶于水，导致核桃蛋白在水中的溶解性较差。在深加工处理阶段，由于加工条件的影响，蛋白质的溶解性变差，在人体内的消化吸收性能降低，营养价值无法更好地被人体吸收利用[4]。因此，提高核桃蛋白粉的溶解性至关重要。酶解改性技术作为生物改性的一种，具有条件温和、专一性强、安全性高等优点，在蛋白质改性方面应用广泛。酶解改性技术主要是通过破坏蛋白质的肽键，使蛋白质内部的亲水基团暴露出来而增加其在水中的溶解性[5-6]。GUAN 等[7]采用胰蛋白酶对燕麦蛋白进行酶解改性处理，使得燕麦蛋白溶解性显著提高，乳化性和起泡性显著下降。MA 等[8]对花生蛋白进行酶解改性处理，使其溶解性显著提高，因此可尝试将胰蛋白酶应用于大豆蛋白制品中。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

1.1.1 试剂

核桃粉（实验室自制）；氯化钠（AR，南京化学试剂股份有限公司）；胰蛋白酶（质谱级，泽叶生物）；去离子水（实验室自制）；HCl、正己烷（AR，上海麦克林生化科技有限公司）；NaOH（AR，南京化学试剂股份有限公司）。

1.1.2 仪器

YJ1002 型电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；JC-9870A 型全自动凯氏定氮仪（青岛智汇谷信息技术有限公司）；SHA-C 水浴恒温振荡器（常州隆和仪器制造有限公司）；DF-101S 集热式恒温加热磁力搅拌器（郑州科华仪器设备有限公司）；TD5Z 型台式低速离心机（湖南凯达科学仪器有限公司）；雷磁PHSJ-6L 型pH 计（上海仪电科学仪器股份有限公司）。

1.2 酶解改性核桃蛋白粉

1.2.1 酶解改性核桃蛋白粉的实验流程

用电子天平准确称取实验用核桃蛋白粉10 g 置于250 mL 的圆底烧瓶中并加入10 mL 的去离子水使其分散溶解得到分散液，将圆底烧瓶置于45 ℃的水浴恒温振荡器中处理10 min，当分散液的温度达到45 ℃后，按照1 000 U·g-1蛋白粉的量加入胰蛋白酶，并采用pH 计测试分散液的pH 值，采用HCl 和NaOH 将分散液的pH 值调整至初始pH 状态，并取样对分散液的水解度进行测试。当核桃蛋白粉的水解度达到2%时，将圆底烧瓶取出，在90 ℃的恒温水浴锅中灭酶处理10 min，处理后将样品冷却冻干。

1.2.2 酶解改性核桃蛋白粉单因素实验分析

根据前人研究成果可知，在酶解改性技术中，酶用量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%和0.7%）、料 液 比（5 ∶1、7 ∶1、9 ∶1、11 ∶1、13 ∶1 和15 ∶1）、酶解温度（30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃和80 ℃）以及酶解时间（10 min、20 min、30 min、40 min、50 min 和60 min）是影响核桃蛋白粉溶解性的关键性因素。本文通过单因素实验分析方法，固定其余变量，改变一个实验条件，探索酶解改性技术提高核桃蛋白粉的溶解性的关键技术指标。

1.3 测试与表征

1.3.1 蛋白质含量测定

根据《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》（GB 5009.5—2016）对核桃蛋白粉的蛋白质含量进行测试[9]。

1.3.2 氨溶指数测定

准确称取核桃蛋白粉样品2 g 并溶解于90 mL 的去离子水中得到蛋白粉溶液，采用HCl 和NaOH 将溶液的pH 调整至2.0 ～9.0 并转移至100 mL 容量瓶中，用去离子水定容至刻度线。在10 000 r·min-1的条件下将溶液高速离心30 min，离心结束后静置10 min测量上清液中的蛋白质含量，上清液中的蛋白含量占样品中总蛋白含量的百分比即为核桃蛋白的氮溶指数（Nitrogen Solubility Index，NSI)。

1.3.3 水解度测定

核桃蛋白粉的水解度（Degree of hydrolysis，DH）根据pH-stat 法进行测试，记录酶解过程中NaOH 的用量。水解度W的计算公式为

式中：W为水解度，%；B为NaOH 的用量，mL；Nb为NaOH 的摩尔浓度，mol·L-1；α为氨基的解离度，胰蛋白酶的校准因子1/α为3.60；Mp为核桃蛋白粉的质量，g；htot为核桃蛋白的肽键总数，7.35 mmol·g-1。

2 结果与分析

2.1 酶用量对核桃蛋白溶解性的影响

在料液比为9 ∶1、酶解温度为50 ℃、酶解时间为30 min 的条件下，分析酶用量对核桃蛋白溶解性的影响。由图1 可知，在酶解改性过程中，随着酶用量的增加，氨溶指数和水解度都呈现明显增加的趋势。当酶用量在0.1%～0.4%时，氨溶指数和水解度的上涨幅度都较大，但是继续增加酶用量至0.7%时，氨溶指数和水解度都出现了一定程度的下降，整体上涨幅度低于酶用量在0.1%～0.4%的上涨幅度。这可能是因为在酶用量较低的情况下，底物未出现酶饱和的现象，随着酶用量的增加，底物与酶充分反应。当酶用量在0.5%～0.7%时，水解度增长幅度高于氨溶指数，这可能是因为在高酶用量的条件下，具有可溶性的酶解产物会被剩余的酶继续酶解，使水解度升高并产生苦味肽。经过综合分析，酶用量在0.4%时的氨溶指数和水解度与0.3%时接近，考虑成本因素，选择最佳酶用量为0.3%。

图1 酶用量对核桃蛋白溶解性的影响图

2.2 料液比对核桃蛋白溶解性的影响

在酶用量为0.3%、酶解温度为50 ℃、酶解时间为30 min 的条件下，分析料液比对核桃蛋白溶解性的影响。由图2 可知，当料液比从5 ∶1 增加至9 ∶1 时，氨溶指数逐渐增加，但是继续增加料液比至15 ∶1 时，氨溶指数呈下降趋势，而水解度随着料液比的增加一直呈增加趋势，特别是当料液比大于11 ∶1 时，水解度近似为线性增长的状态，增加速度明显。这可能是因为当分散液浓度较大时，底物与蛋白酶的接触不充分，反应不完全，从而导致氨溶指数以及水解度较低。但随着料液比的增加，分散液浓度降低，使得底物与蛋白酶接触更加充分，反应更加完全，使不溶性蛋白水解成为可溶性蛋白。当继续提高料液比时，可溶性蛋白会继续发生水解而形成小分子的肽，在此过程中会有部分疏水性肽形成而导致氨溶指数下降。因此，当料液比为9 ∶1 时，核桃蛋白粉的溶解性较好。

图2 料液比对核桃蛋白溶解性的影响图

2.3 酶解温度对核桃蛋白溶解性的影响

在酶用量为0.3%、料液比为9 ∶1、酶解时间为30 min 的条件下，分析酶解温度对核桃蛋白溶解性的影响。由图3 可知，随着酶解温度的升高，氨溶指数先增加后减小，当酶解温度为40 ℃时，氨溶指数最大，而水解度随着酶解温度的增加呈现持续增加的趋势。这可能是因为在温度较低的条件下，酶解温度升高时蛋白酶的活性较高，反应速度加快。但是当酶解温度达到一定值时，过高的温度会加剧体系内分子之间的运动，增加蛋白酶和底物之间的碰撞概率，反应更加充分，蛋白质水解速度更快。同时，过度水解会造成不溶性肽的产生。因此，需在氨溶指数以及水解度之间寻找平衡，当酶解温度为40 ℃时，溶解性较好。

图3 酶解温度对核桃蛋白溶解性的影响图

2.4 酶解时间对核桃蛋白溶解性的影响

在酶用量为0.3%、料液比为11 ∶1、酶解温度为40 ℃的条件下，分析酶解时间对核桃蛋白溶解性的影响，详见图4。

图4 酶解时间对核桃蛋白溶解性的影响图

由图4 可知，在10 ～40 min 时，随着酶解时间的增加，氨溶指数以及水解度都明显增加。这主要是因为随着时间的延长，蛋白酶与蛋白质之间的作用更加充分，使核桃蛋白粉的溶解度增加。但是当酶解时间继续增加时，氨溶指数以及水解度的增加逐渐平缓，这主要是因为当酶解时间过长时，酶切位点会逐渐减少，会导致酶的活性减弱，从而导致核桃蛋白粉的氨溶指数以及水解度增长变缓。综上，当酶解时间为40 min 时，核桃蛋白粉的溶解效果较好。

3 结论

本文使用胰蛋白酶对核桃蛋白粉进行酶解改性，采用单因素实验分析法对酶解改性过程中酶用量、料液比、酶解温度以及酶解时间对核桃蛋白酶解后的氨溶指数以及水解度进行了分析，当酶用量为0.3%、料液比为9∶1、酶解温度为40 ℃、酶解时间为40 min时，核桃蛋白粉的氨溶指数较高，核桃蛋白粉的溶解性较好，可直接应用于食品中。