常绿钩吻碱对人结肠癌细胞增殖、凋亡的影响

陈 亮，聂平平

福州市中医院，福建 福州 350001

钩吻，又名断肠草、大茶药、野葛等，为马钱科植物胡蔓藤Gelsemiumelegans(Gardn.etchamp) Benth.的全草，是有毒植物，在我国主要分布在我国浙江、福建、广东、广西、贵州、云南等地[1]。钩吻具有破瘕积的功效[2]，现代药理研究[3]发现钩吻具有镇痛、抗炎、抗肿瘤等作用。曾有医者将钩吻总生物碱制成注射剂应用于临床治疗癌性疼痛取得一定疗效[4]，钩吻生物碱的毒性也对其临床应用带来一定限制，也需要进一步研究相关作用机制，以便能够更好地应用于临床。笔者前期研究发现钩吻中提取出的常绿钩吻碱具有较强抑制人结肠癌细胞HT-29增殖的作用，但是具体机制尚未明确。本研究利用MTT实验、DAPI染色及western-blot等研究方法，从Bcl-2/Bax途径诱导细胞凋亡的角度出发，探讨常绿钩吻碱抗结肠癌作用的机制。

1 材料

1.1 药物与细胞 常绿钩吻碱，由昆山远慕生物技术有限公司提供(纯度>99%，货号YM-0065)，配制前用二甲基亚砜(DMSO)溶液配制成5 mg/mL的母液，于4 ℃保存待用。人结肠癌HT-29细胞株，由江苏凯基生物技术股份有限公司提供(货号KGG3225-1)。

1.2 试剂和仪器 南美胎牛血清(美国Hyclone公司，货号SV30087.02)；双抗青链酶素(10000units/mL，10000μg/mL链霉素。美国Hyclone公司，货号SV30010)；McCoys’5A液体培养基(武汉博士德公司，货号PYG0026)；胰蛋白酶-EDTA(美国Hyclone公司，货号SH30042.01)；二甲基亚砜(DMSO)溶液(北京索莱宝公司，货号D8371)；噻唑蓝(MTT)干粉(江苏凯基公司，货号KGH3101-1)；细胞凋亡DAPI染色剂试剂盒(江苏凯基公司，货号KGA215)；RIPA细胞裂解液(上海碧云天公司，货号P0013B)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天公司，货号P0011)；一抗稀释液(上海碧云天公司，货号P0023A)；二抗稀释液(上海碧云天公司，货号P0023D)；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(上海碧云天公司，货号P0012A)；SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(上海碧云天公司，货号P0015)；超敏ECL化学发光试剂盒(上海碧云天公司，货号P0018S)；β-actin蛋白一抗(英国abcam公司，货号ab8226)；Bcl-2蛋白一抗(英国abcam公司，货号ab59348)；Bax蛋白一抗(英国abcam公司，货号ab32503)；二抗(北京全式金公司，货号HS201-01、HS101-01)；ELX800酶标仪(美国BioTek公司)；二氧化碳培养箱(中国力康公司)；IX7荧光倒置相差显微镜(日本OLYMPUS公司)；洁净工作台(苏州泰安空气技术有限公司)；25 cm2培养瓶、96孔培养板、6孔培养板(美国Corning公司)；Gel DOC 2000 型凝胶成像分析系统(美国Bio-rad公司)。

2 方法

2.1 HT-29细胞培养 用含10%胎牛血清、1%双抗青链酶素的McCoys’5A液体培养基置于37℃、5%CO2培养箱中培养。

2.2 MTT实验 取对数生长期的HT-29细胞用0.25%胰蛋白酶消化，收集细胞以McCoys’5A培养液制成细胞悬液，调整细胞密度为5×104个/mL分别接种于3块96孔培养板中，每孔100 μL，常规培养24 h后，使细胞贴壁。吸弃原培养液，根据前期预实验观察到常绿钩吻碱对HT-29细胞增殖的抑制情况，将细胞分为实验组(常绿钩吻碱终质量浓度分别为4 μg/mL、6 μg/mL、8 μg/mL的培养液培养)，对照组(等体积不含常绿钩吻碱的培养液培养)及调零组(不含细胞直接加等体积的培养液)，以上5组各设6个复孔，培养24 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT溶液10 μL，37 ℃孵育4 h，然后吸取各孔中的液体加入二甲基亚砜(DMSO)100 μL/孔 ，振荡混匀，并于室温放置10 min，使结晶充分溶解并混匀，在ELX800酶标仪于570 nm处测定5组吸光度值(即OD值)，抑制率=1-(实验组-调零组)/(对照组-调零组)。以上实验重复3次。

2.3 细胞形态学观察 将取对数生长期的HT-29接种于6孔培养板中，每孔2 mL培养液，常规培养24 h后，吸弃原培养液，细胞分为实验组(用常绿钩吻碱终质量浓度分别为4 μg/mL、6 μg/mL、8 μg/mL的培养液培养)，对照组(等体积不含常绿钩吻碱的培养液培养)。HT-29细胞用常绿钩吻碱干预培养24 h后，用IX7荧光倒置相差显微镜观察细胞的形态及变化，并拍照。

2.4 DAPI染色液染色观察 HT-29细胞的凋亡情况 将取对数生长期的HT-29接种于6孔培养板中，每孔2 mL培养液，常规培养24 h后，吸弃原培养液，细胞分为实验组(用常绿钩吻碱终质量浓度分别为4 μg/mL、6 μg/mL、8 μg/mL的培养液培养)，对照组(等体积不含常绿钩吻碱的培养液培养)，HT-29细胞用常绿钩吻碱干预培养24 h后，吸弃原培养液，每孔用1 μg/mL的DAPI染色液500 μL漂洗后，弃去染色液，每孔再加1 μg/mL的DAPI染色液500 μL，37 ℃孵育染色15 min，弃去染色液，后每孔加500 μL无水甲醇溶液漂洗，弃去甲醇溶液，每孔加入500μL Buffer后，用IX7荧光倒置相差显微镜观察细胞的凋亡情况。

2.5 western-blot检测Bcl-2和Bax蛋白 取对数生长期的HT-29细胞胰酶消化后，取3×106个/mL接种于6孔板中，每孔2 mL培养液，常规培养24 h后。吸弃原培养液，细胞分为实验组(用常绿钩吻碱终质量浓度分别为4 μg/mL、6 μg/mL、8 μg/mL的培养液培养)，对照组(直接加等体积的培养液)。继续培养24 h后，用预冷的PBS洗涤2次，收集细胞加入细胞裂解液150 μL，4 ℃裂解30 min，收集细胞裂解液，14000 rpm离心15 min，收集上清液，BCA试剂测定蛋白含量，加入5×蛋白上样缓冲液至终浓度为1×，100 ℃蛋白变性5 min，上样于SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶，每孔20 μg蛋白进行电泳分离。将蛋白转至PVDF膜，加入含5%脱脂奶粉封闭液封闭2 h，一抗(β-actin、Bcl-2、Bax蛋白用一抗稀释液1∶1000稀释)4 ℃过夜，TBST洗膜3次，每次10 min，二抗(以1∶8000用二抗稀释液稀释)室温孵育2 h，TBST漂洗3遍，每遍10 min，ECL化学发光显色，以β-actin为内参基因，用Image Lab软件进行显色分析，以上实验重复3次。

3 结果

3.1 常绿钩吻碱对于HT-29细胞增殖的影响 质量浓度4 μg/mL常绿钩吻碱干预24 h后，即对HT-29细胞增殖有明显的抑制作用(P<0.05)。随着药物浓度的提高及干预时间的延长，HT-29的抑制率也升高，呈明显的时间剂量依赖。8 μg/mL常绿钩吻碱干预24 h后，对 HT-29 细胞增殖的平均抑制率可达58.81%，使用SPSS 17.0计算IC50约为7.48 μg/mL。详见表1。

表1 常绿钩吻碱对于HT-29细胞增殖的影响情况表(常绿钩吻碱干预 24 h)

3.2 常绿钩吻碱对于HT-29细胞形态的影响(干预24 h) 空白对照组细胞胞质均匀，细胞核仁清晰，呈良好的贴壁生长，如图1A所示。实验组当常绿钩吻碱质量浓度为4 μg/mL作用24 h时，可明显观察到细胞胞质混浊，细胞体积缩小，开始出现细胞悬浮、脱落，甚至死亡，如图1B所示；随着剂量的增加细胞状态越差，细胞数量逐渐减少如图1C和图1D所示。实验结果显示常绿钩吻碱对于HT-29细胞有明显的抑制作用，并随浓度的增加逐渐增强，呈现一定的量效关系。

A.0 μg/mL；B.4 μg/mL；C.6 μg/mL；D.8 μg/mL

3.3 常绿钩吻碱对于HT-29细胞凋亡的影响(干预24 h) DAPI染色剂染色后，空白对照组HT-29细胞染色均匀，细胞核呈圆形，边缘清晰，如图2A所示。实验组常绿钩吻碱干预后凋亡的细胞出现蓝色荧光，细胞核边缘不规则，核小体碎片增加。随着药物剂量的增加，HT-29细胞的数量逐渐减少，表明常绿钩吻碱可促进HT-29细胞凋亡。如图2B、C、D所示。

A.0 μg/mL；B.4 μg/mL；C.6 μg/mL；D.8 μg/mL

3.4 western-blot检测 常绿钩吻碱对于HT-29细胞Bcl-2、Bax蛋白表达的影响(干预24 h) 与对照组相比，实验组各组Bcl-2蛋白的表达逐渐降低(P<0.05)，而Bax蛋白的表达无明显变化(P>0.05)，表明常绿钩吻碱可降低HT-29细胞Bcl-2蛋白的表达，但对Bax蛋白的表达无明显影响。如图3和图4所示。

图3 常绿钩吻碱对HT-29细胞Bcl-2、Bax蛋白表达影响的电泳情况图

注：与对照组相比，*P<0.05，**P>0.05

4 讨论

细胞凋亡是机体维持稳定的重要保护机制之一，细胞凋亡率的减少是肿瘤发生的关键性步骤。肿瘤发展过程中增殖与凋亡平衡的破坏，导致肿瘤细胞无限增殖[5]。

Bcl-2和Bax蛋白均属于Bcl-2家族，Bcl-2可抑制细胞凋亡，Bax则为促凋亡蛋白，Bcl-2家族是凋亡调控的重要分子，在肿瘤中Bcl-2家族成员表达异常，导致肿瘤细胞能够逃逸凋亡，保持持续的增殖能力，Bcl-2定位于线粒体膜，Bax则主要以单体形式定位于细胞浆，当受到凋亡刺激时，Bax发生构象改变，从胞浆移位到线粒体外膜形成二聚体或寡聚体并插入线粒体膜，导致线粒体跨膜电位下降和促凋亡分子的释放，进而促发线粒体介导的凋亡通路，Bcl-2可与Bax形成异二聚体，阻碍Bax等促凋亡蛋白的功能，抑制细胞色素C(Cyt-c)和凋亡诱导因子(AIF)的释放，起到抑制细胞凋亡的作用[6]。Bcl-2/Bax异常升高可见于多种肿瘤之中，Bax/Bcl-2与细胞凋亡密切相关[7]。

结肠癌是一种发病率和死亡率都很高的恶性肿瘤[8]。结肠癌的发病与遗传、环境因素、饮食及生活习惯均密切相关，其发病涉及多因素、多个阶段及不同基因的变化。细胞凋亡程序的失常与结肠癌的发病密切相关。有研究表明Bcl-2表达量可影响结肠组织的恶变程度，从而影响结肠癌的发生发展[9]。

目前，中药的抗肿瘤作用越来越受到重视，以其副作用少、疗效确切的特点受到许多研究者关注。中药对于逆转肿瘤耐药也具有一定作用[10]。研究中药中的有效抗肿瘤成分将有助于抗肿瘤药物的研发。随着对中药生物碱研究的不断深入，越来越多的生物碱被发现具有抗肿瘤作用，中药生物碱成分的抗肿瘤机制主要有抑制肿瘤细胞增殖，诱导细胞凋亡，抑制细胞侵袭转移，影响肿瘤细胞自噬和调节免疫功能等，可通过调控 PI3K/AKT、AKT/mTOR、JNK/p38 MAPK、Wnt/β-catenin 等相关信号通路，多环节、多途径参与到肿瘤增殖、凋亡、侵袭转移及自噬过程中，影响肿瘤的发生发展[11]。

钩吻含有钩吻素子、钩吻素甲、钩吻素己、钩吻绿碱等多种生物碱成分[12]。吴达荣等[13]的实验证明钩吻生物碱的主要成分钩吻素子在体外对于人结肠癌细胞Lovo有抑制作用。黄静等[14]也通过实验发现钩吻生物碱中的钩吻素子、钩吻素甲、钩吻素己和1-甲氧基钩吻碱对人结肠癌细胞SW480增殖具有显著的抑制作用。本课题前期研究[15]发现钩吻总生物碱可抑制人结肠癌HT-29细胞的增殖，也可抑制人脐静脉内皮细胞HUVEC的增殖及迁移[16]，具有一定抑制血管新生的作用。常绿钩吻碱是钩吻生物碱中含有的单体成分之一。有研究[17]通过体外细胞培养及裸鼠移植瘤实验发现常绿钩吻碱可抑制人神经胶质瘤细胞U251生长，用100 mg/kg的常绿钩吻碱灌胃给药小鼠时也未发现对正常小鼠存在明显毒性作用。目前钩吻生物碱抗肿瘤作用的研究仍较少，本研究通过常绿钩吻碱体外作用于HT-29细胞，利用MTT试验及倒置相差显微镜观察到常绿钩吻碱可抑制人结肠癌细胞HT-29的增殖，表现出明显量效关系。另外，通过DAPI染色法证实常绿钩吻碱可促进HT-29细胞凋亡。western-blot检测发现常绿钩吻碱可显著下调Bcl-2的蛋白表达(P<0.05)，对Bax的蛋白表达未见明显影响(P>0.05)。由此我们推测常绿钩吻碱可能通过减少HT-29细胞Bcl-2蛋白的表达，从而减轻细胞对凋亡的抑制作用，而非直接促进细胞凋亡，因而对Bax蛋白的表达无明显影响。这也为常绿生物碱抗肿瘤作用的研究提供了一定理论参考。