苏黄止咳胶囊对豚鼠咳嗽高敏模型的抗炎止咳作用研究

李锦帅,杨子娴,王 韬,贾 丹,王亚琼,熊 广,谢 纬,陈 生,李敏芳,4

(1.广州中医药大学第四临床医学院,广东 深圳 518033;2.深圳市中医院,广东 深圳 518033;3.暨南大学中医学院,广东 广州 510632;4.广州中医药大学第二临床医学院,广东 广州 510006)

咳嗽高敏综合征病因尚不明确,主要特征为对各种刺激性物质或条件产生异常敏感的咳嗽反应,临床中以慢性刺激性干咳为主要表现,目前其发病机制存在争议[1-2]。相关研究表示,慢性咳嗽患者普遍存在气道管壁增厚、支气管上皮受损伴杯状细胞增生、基底膜增厚和肥大细胞慢性炎症浸润[3-4]。大量慢性咳嗽患者存在肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、神经肽P物质(Substance P,SP)、降钙素基因相关肽(Calcitonin gene-related peptide,CGRP)高水平[5-8]。目前咳嗽高敏综合征临床治疗效果不理想,且存在较多不良反应,给患者的社交、心理等方面带来了极大的负担[9-10]。国医大师晁恩祥认为咳嗽敏感性增高的特点与风邪致病特点之“风善行数变”“风性挛急”“无风不作痒”等相契合,故将其归属于“风咳”范畴,并提出治疗时应从“风”论治,以疏风宣肺、缓急止咳为法[11]。国医大师晁恩祥结合多年临床经验研制出苏黄止咳胶囊[12]。多项研究表明苏黄止咳胶囊治疗感染后咳嗽、咳嗽变异性哮喘等呼吸系统疾病安全有效[13-16]。现代药理学证实苏黄止咳胶囊组成中9种中草药具有75种活性成分[17]。其中五味子的活性物质总木脂素具有治疗慢性咳嗽的潜力[18]。基于苏黄止咳胶囊良好的抗炎止咳效果,本研究旨在对苏黄止咳胶囊改善咳嗽高敏模型的抗炎止咳作用进行探究。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物:普通级别雄性白化豚鼠36只,体重为300～350 g,皆购自珠海百试通生物科技公司,生产许可证号:SCXK(粤)2020-0051。以上豚鼠在广州中医药大学实验动物中心饲养,许可证号:SYXK(粤)2018-0085。

1.1.2 实验药物与试剂:苏黄止咳胶囊(国药准字23060991);磷酸可待因片(批号20190601,国药集团);苯酚、浓硫酸、乙醇、水合柠檬酸(批号90-72-2、64-17-5、7664-93-9、5949-29-1,西陇科学);磷酸盐缓冲液(批号MA0015,Meilunbio公司);红细胞裂解液(批号HRA2081,荷瑞生物);4%多聚甲醛(批号HM0123,广州浩玛);苏木素、伊红染液(批号 G1004、G1005,西陇科学);IL-1β、TNF-α试剂盒(批号 JER-01、JER-06,安徽巧伊);SP试剂盒(批号D751030,上海生工);CGRP试剂盒(批号 CSB-E08211r,华美生物)。

1.1.3 实验仪器:大动物用全身体积描记系统(WBP型,上海塔望智能科技);低温离心机(5430R型,美国Thermo Scientific公司);多功能血细胞分类仪(BM2型,东吴医用电子仪器厂);多功能酶标仪(Multiskan GO型,美国Thermo Scientific公司);实验室用制冰机(MR46AS+NB393型,上海冠森生物);混合研磨器(LUKYM-1型,广州华创);超声波雾化器(WH-2000型,广东粤华)。

1.2 实验方法

1.2.1 豚鼠分组、造模及给药:36只豚鼠按照随机分组原则分为空白对照组、模型组、可待因组以及苏黄止咳胶囊低、中、高剂量组,每组6只。首先适应性喂养1周,随后,除空白对照组外,其他组参照参考文献[19]建立烟草烟雾诱导的咳嗽高敏豚鼠模型。具体操作为将豚鼠置于烟雾染毒箱,烟熏14 d,2次/d,每次20 min,并确保两次烟熏的时间间隔大于6 h。第15天对豚鼠进行灌胃给药。苏黄止咳胶囊低、中、高剂量组分别予0.18、0.36、1.8 g/(kg·d)苏黄止咳胶囊溶液灌胃。可待因组接受磷酸可待因混悬液30 mg/kg灌胃。空白对照组和模型组豚鼠则灌胃等体积的0.9%氯化钠溶液。

1.2.2 豚鼠咳嗽敏感性检测:末次给药1 h后,将豚鼠单独置于密封的透明暴露箱(25 cm×12 cm×12 cm)中,暴露箱两侧均有换气口,开始进行暴露。使用超声雾化器雾化引咳剂,可使其在空气中的颗粒直径保持在1～5 μm,每分钟雾化0.5 mol/L的含水柠檬酸0.5 ml,雾化5 min,观察10 min。由经过训练的2名观测者连续监测豚鼠的咳嗽次数及声音。同时使用大动物用全身体积描记系统记录豚鼠的咳嗽次数以及咳嗽潜伏期。

1.2.3 豚鼠肺泡灌洗液取材及处理:固定豚鼠,腹腔注射3%戊巴比妥钠溶液麻醉,随后进行气管切开和插管,并同时结扎右肺,以6 ml预冷的0.9%氯化钠溶液分3次缓慢注入左肺进行灌洗。将得到的BALF置于10 ml的离心管中,以1500 r/min的速度在4 ℃条件下离心5 min。离心后,轻轻吸取离心管上清液,然后将其分装至洁净的离心管中,并保存至-80 ℃冰箱备用,ELISA法检测相关细胞因子水平。

1.2.4 炎症细胞计数与分类:将离心后的BALF细胞沉淀加入500 μl的PBS溶液,然后悬浮细胞,取10 μl的悬浮液加入血细胞计数板,借助光学显微镜对各类炎症细胞进行计数。取100 μl细胞悬液制备细胞涂片,自然风干后置于10%中性福尔马林中进行细胞形态的固定,固定时间大于24 h。HE染色、干燥后,对炎症细胞进行分类计数。

1.2.5 BALF中炎症因子检测:遵循试剂盒的详细操作说明,采用ELISA法测定BALF中的炎症因子IL-1β、TNF-α、SP、CGRP水平。

1.2.6 气道组织及肺组织病理观察:取得主支气管及右下肺组织后,置于10%福尔马林溶液中浸泡固定,然后进行石蜡包埋,制备切片厚度为4 μm。经过HE染色,最后在光学显微镜下观察肺组织的病理改变。

2 结 果

2.1 苏黄止咳胶囊对咳嗽高敏豚鼠咳嗽次数及咳嗽潜伏期的影响 见表1。与空白对照组比较,模型组豚鼠的咳嗽次数增加,咳嗽潜伏期缩短(均P<0.01);苏黄止咳胶囊各剂量组及可待因组相对于模型组,咳嗽次数显著减少(P<0.01),咳嗽潜伏期延长(P<0.05,P<0.01)。

表1 各组豚鼠咳嗽次数及咳嗽潜伏期比较

2.2 苏黄止咳胶囊对咳嗽高敏豚鼠BALF中炎症细胞的影响 见表2。模型组BALF中白细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞淋巴细胞计数均显著高于正常对照组(P<0.05,P<0.01);苏黄止咳胶囊各剂量组BALF中白细胞、中性粒细胞均显著低于模型组(P<0.01);苏黄止咳胶囊高剂量组BALF中的嗜酸性粒细胞计数显著低于模型组(P<0.05);苏黄止咳胶囊低剂量组BALF中淋巴细胞计数低于模型组(P<0.05)。

表2 各组豚鼠BALF中炎性细胞计数比较(×109/L)

2.3 苏黄止咳胶囊对咳嗽高敏豚鼠BALF中IL-1β、TNF-α、SP、CGRP水平的影响 见表3。模型组BALF中的IL-1β、TNF-α、SP、CGR水平均显著高于空白对照组(P<0.01)。苏黄止咳胶囊中、高剂量组BALF中的IL-1β、TNF-α、SP、CGRP水平均显著低于模型组(P<0.01)。

表3 各组豚鼠BALF中IL-1β、TNF-α、SP、CGRP水平比较(pg/ml)

2.4 苏黄止咳胶囊对咳嗽高敏豚鼠肺组织病理学的影响 见图1。空白对照组豚鼠的肺组织镜下显示气道上皮细胞整齐排列,无充血和水肿,肺泡结构完整,炎症浸润较少,气管腔内也未见明显炎性浸润。模型组和可待因组豚鼠的肺组织镜下显示气道上皮细胞排列紊乱,气管和细支气管黏膜炎性水肿,炎症细胞浸润显著,管腔中存在大量渗出物,肺泡间隔增宽,部分肺泡出现塌陷。与模型组相比,苏黄止咳胶囊各剂量组豚鼠肺组织中炎症浸润减轻,管腔渗出物也显著减少。

A:空白对照组;B:模型组;C:可待因组;D:苏黄止咳胶囊低剂量组;E:苏黄止咳胶囊中剂量组;F:苏黄止咳胶囊高剂量组图1 各组豚鼠肺组织病理学改变(HE染色,×200)

3 讨 论

咳嗽高敏综合征的发生受多种因素影响,比如气道炎症、咳嗽中枢敏化和神经源性炎症等[20]。气道炎症在咳嗽高敏综合征中占重要作用,当呼吸道黏膜受到外界刺激时,会激活气道炎症反应,导致中性粒细胞计数增加,本研究中苏黄止咳胶囊各剂量组显著低于模型组豚鼠BALF中白细胞计数及中性粒细胞计数水平,表明苏黄止咳胶囊有助于抑制气道炎症细胞的释放。气道炎症反应发生的同时伴随IL-1β、TNF-α等炎症介质水平的升高[21],这些炎症介质的刺激可激活咳嗽感受器,进而提高咳嗽纤维传入神经末梢C纤维的敏感性,从而导致咳嗽阈值下调。本研究中低、中、高剂量苏黄止咳胶囊可显著下调BALF中IL-1β、TNF-α水平,气道炎症介质的释放减少可进一步减少对咳嗽感受器的刺激且能降低咳嗽纤维传入神经的敏感性;当咳嗽中枢被激活时,SP物质的释放增加会导致传入信号的放大和咳嗽反应的加强。研究表明,使用SP拮抗剂治疗后,豚鼠的咳嗽敏感性明显减弱[22]。目前认为C纤维被激活后神经递质释放增多可能在慢性咳嗽中扮演重要角色,C纤维中释放的神经递质主要包括SP、CGRP等,在吸入刺激性物质后可诱导SP释放增多并引起咳嗽,且慢性咳嗽患者咳嗽敏感性与其BALF中CGRP水平呈正相关[23]。本研究中,中、高剂量苏黄止咳胶囊可显著下调BALF中SP、CGRP水平,SP物质的减少可以减弱咳嗽传入信号且使气道对刺激的敏感性降低,CGRP水平的下降可以减轻咳嗽反应且进一步降低咳嗽敏感性。

晁恩祥教授对咳嗽、肺痿等疾病有较深的见解,苏黄止咳胶囊由国医大师晁恩祥研发[24]。临床中部分患者咳嗽症状迁延难愈且突发突止,运用常规散寒、清热等方法不能奏效。国医大师晁恩祥结合多年临床经验,认为咳嗽遇刺激性而发、突发突止、咽痒等特点与风邪致病特点相契合,由此创立“风咳”理论,将其病因病机归纳为风邪犯肺,肺失宣肃,并强调治疗时应从风论治。苏黄止咳胶囊诸药并用,共奏疏风宣肺、止咳利咽之功,可以有效缓解咳嗽症状并改善肺功能[25-26],且现代药理学证明苏黄止咳胶囊具有抗组胺、降低炎症因子水平等作用[27]。

综上所述,苏黄止咳胶囊可能通过抑制气道炎症的发生和炎症介质的释放,减少刺激咳嗽感受器,并且还可能通过下调SP、CGRP的水平,缩小咳嗽传入信号并且减轻咳嗽反应,最终降低豚鼠模型的咳嗽敏感性,然而具体的通路仍需进一步研究。本研究为治疗咳嗽高敏综合征提供了新的思路,但本研究为动物研究,选用的豚鼠均为雄性,可能会对研究结果造成偏倚,未来还需要在真实世界中进行人类大样本的随机对照试验来验证其具体作用。