基于JNK/p38 MAPK/NF-κB信号通路探究八桂止痛散对脂多糖诱导脊髓星形胶质细胞凋亡的影响

廖承成,尹瑞文,张洪卫,张 爽,李 霞,彭国瑶,聂欣怡

(1.云南中医药大学第一临床医学院皮肤科,云南 昆明 650021;2.云南中医药大学第一临床医学院脑病科,云南 昆明 650021)

神经病理性疼痛是由神经系统疾病或损伤引起的慢性继发性疼痛[1]。神经炎症与神经病理性疼痛密切相关,炎症诱导的脊髓神经胶质细胞包括小胶质细胞和星形胶质细胞参与了神经病理性疼痛的发展[2]。小胶质细胞和星形胶质细胞活化与JNK、p38 MAPK活化过程有关,使得MAPK家族成为神经病理性疼痛研究的潜在靶点[3]。八桂止痛散主要由八角枫、透骨草、桂枝以及大黄等组成,具有通络止痛、活血化瘀之功效,将其应用于神经病理性疼痛治疗的研究甚少。八桂止痛膏与此成分相似,其在多种疼痛性疾病疗效显著,具有抗炎、镇痛等作用[4]。故推测八桂止痛散可能对神经病理性疼痛治疗有效,因此文章通过LPS诱导脊髓星形胶质细胞建立细胞损伤模型,观察八桂止痛散对细胞凋亡、炎症以及相关机制的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验细胞:自湖南斯莱克景达实验动物有限公司购买SD乳鼠(出生时间短于3 d),合格证号:SCXK(湘)2019-0004,使用碘伏和75%酒精进行小鼠全身消毒,在无菌超净操作台上固定,迅速剪掉乳鼠头颅,置于冰上剪开背侧以脊柱为中心的皮肤肌肉,将剪刀从头侧伸入胸腔沿脊柱剪断肋骨,取出脊柱、剖开腹侧椎骨,剥离椎骨,取出脊髓,用无菌剪将脊髓剪切成碎块,加入胰蛋白酶消化,缓缓吹打混匀,消化30 min后终止消化,吸管吹散至组织块消失,制备单细胞悬液,离心、去上清液,收集细胞接种于培养瓶中,置于细胞孵育箱中进行培养,待细胞融合度达到90%以上时,再进行消化传代培养。生长到第3～4代时,可得到成熟且纯化度达到90%以上的脊髓星形胶质细胞,使用免疫荧光法染色鉴定。

1.1.2 实验试剂:Med Chem Express公司提供p38 MAPK激活剂-Anisomycin;上海酶联科技有限公司提供白细胞介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)试剂盒;碧云天公司提供RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒;Thermo Fisher公司提供GFAP抗体;Abcam公司提供JNK、p38 MAPK、NF-κB p65、p-JNK、p-p38 MAPK和p-NF-κB p65一抗。

1.1.3 实验仪器:奥林巴斯提供BX53荧光显微镜;Tanon提供凝胶成像仪;BIO-RAD提供垂直电泳槽、湿式转膜槽;美国Molecular公司提供SPECTCA MAX190酶标仪。

1.2 实验方法

1.2.1 免疫荧光法染色鉴定星形胶质细胞:在培养板中将爬片用PBS浸洗,多聚甲醛固定、Triton X-100通透,5%正常羊血清封闭,加入GFAP一抗,PBST漂洗,加入合适浓度的荧光标记二抗,滴加50 μl的抗淬灭封片剂(含DAPI)封片,荧光显微镜下拍照。

1.2.2 CCK-8法检测细胞存活:将对数生长期的星形胶质细胞制备成5×104/ml的细胞悬液,以每孔100 μl的量接种于96孔板中。24 h后,给药组分别加入100 μl含不同浓度八桂止痛散(2.5、5、10、20、40、80 mg/ml)的培养液,每个浓度梯度设6个平行孔;对照组每孔加入100 μl培养液。48 h后,每孔加入10 μl的CCK-8溶液,继续培养4 h,在酶标仪上测定450 nm波长处OD值,计算细胞存活率。

1.2.3 细胞分组及处理:收集对数生长期的星形胶质细胞,设置对照组、LPS组、LPS+药物低剂量(药物-L)组、LPS+药物中剂量(药物-M)组、LPS+药物高剂量(药物-H)组、LPS+药物-H+Anisomycin组,其中LPS组根据前期研究及文献[5]以1 μg/ml的LPS处理细胞;LPS+药物-L组、LPS+药物-M组、LPS+药物-H组分别以1 μg/ml的LPS处理细胞,24 h后加入5、10、20 mg/ml八桂止痛散培养细胞;LPS+药物-H+Anisomycin组以1 μg/ml的LPS处理细胞,24 h后加入20 mg/ml八桂止痛散、300 ng/ml Anisomycin同时处理细胞[6];对照组不进行细胞处理,48 h后进行指标检测。处理结束后收集上述细胞,CCK-8法检测细胞存活。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡:收集细胞,加入0.25%胰酶并放回培养箱中消化,将细胞悬液移至离心管中,每管加入5 μl的FITC染料,避光孵育15 min后,随后每管加入10 μl的PI染料,避光孵育5 min后,流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.2.5 ELISA法检测IL-1β、IL-6、TNF-α水平:收集细胞,离心取上清,按照试剂盒要求检测IL-1β、IL-6、TNF-α水平。

1.2.6 qRT-PCR检测细胞中JNK、p38 MAPK、NF-κB p65基因水平:PBS洗涤细胞,加入Trizol裂解液,在冰浴环境下裂解,提取总RNA;利用ND-1000分光光度计检测RNA浓度,按照Fast King RT Kit Fast King cDNA合成试剂盒说明进行逆转录,向96孔PCR板中依次加入Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix、上游引物、下游引物、cDNA模板以及Nuclease-Free Water,设置PCR循环反应条件,反应结束后,利用2-ΔΔCt分析JNK mRNA、p38 MAPK mRNA、NF-κB p65 mRNA表达。引物序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.7 Western blot检测JNK/p38 MAPK/NF-κB通路相关蛋白表达水平 每孔细胞(6孔板)中加入500 μl的RIPA裂解液(含50 μl蛋白酶抑制剂),冰浴环境下静置10 min,用刮刀收集细胞,并检测蛋白浓度,调整各个样品的蛋白上样量,以SDS-PAGE电泳分离,采用湿转法转膜,PVDF膜置于5%的牛血清白蛋白中,分别加入JNK、p38 MAPK、NF-κB p65、p-JNK、p-p38 MAPK、p-NF-κB p65一抗,放置4 ℃冰箱中过夜,去除一抗液体,加入二抗,化学发光、显影、定影后,分析蛋白质条带的灰度值。

1.3 统计学方法 应用SPSS 26.0统计学软件分析结果。以均数±标准差表示数据,多组间比较采用单因素方差分析,两两比较行SNK-q检验;P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 星形胶质细胞鉴定 免疫荧光鉴定结果(图1)显示,特征基因GFAP阳性表达达到95%以上,表明提取得到的细胞为星形胶质细胞。

图1 星形胶质细胞的鉴定(×400)

2.2 不同浓度的八桂止痛散对星形胶质细胞存活率的影响 见表2。5、10、20、40 mg/ml八桂止痛散均可抑制星形胶质细胞存活,其中以20 mg/ml八桂止痛散处理时,星形胶质细胞存活率接近50%,将其作为药物处理的最高浓度,5、10 mg/ml八桂止痛散为低、中浓度进行后续实验。

表2 不同浓度的八桂止痛散对星形胶质细胞存活率的影响(%)

2.3 八桂止痛散对LPS诱导的星形胶质细胞存活率的影响 与对照组相比,LPS组细胞存活率显著降低(P<0.05);与LPS组相比,LPS+药物-L组、LPS+药物-M组、LPS+药物-H组细胞存活率显著增加,具有剂量依赖性(均P<0.05);与LPS+药物-H组相比,LPS+药物-H+Anisomycin组细胞存活率显著降低(P<0.05)。见表3。

表3 各组细胞存活率比较(%)

2.4 八桂止痛散对LPS诱导的星形胶质细胞凋亡率的影响 与对照组相比,LPS组细胞凋亡率显著增加(P<0.05);与LPS组相比,LPS+药物-L组、LPS+药物-M组、LPS+药物-H组细胞凋亡率显著降低,具有剂量依赖性(均P<0.05);与LPS+药物-H组相比,LPS+药物-H+Anisomycin组细胞凋亡率显著增加(P<0.05)。见图2(表4)。

图2 各组细胞凋亡率变化比较

表4 各组细胞凋亡率比较(%)

2.5 八桂止痛散对LPS诱导的星形胶质细胞IL-1β、IL-6、TNF-α水平的影响 与对照组相比,LPS组IL-1β、IL-6、TNF-α水平显著增加(均P<0.05);与LPS组相比,LPS+药物-L组、LPS+药物-M组、LPS+药物-H组IL-1β、IL-6、TNF-α水平显著降低,具有剂量依赖性(均P<0.05);与LPS+药物-H组相比,LPS+药物-H+Anisomycin组IL-1β、IL-6、TNF-α水平显著增加(均P<0.05)。见表5。

表5 各组细胞IL-1β、IL-6、TNF-α水平比较(pg/ml)

2.6 八桂止痛散对LPS诱导的星形胶质细胞JNK、p38 MAPK、NF-κB p65 mRNA表达水平的影响 与对照组相比,LPS组JNK、p38 MAPK、NF-κB p65 mRNA表达显著增加(均P<0.05);与LPS组相比,LPS+药物-L组、LPS+药物-M组、LPS+药物-H组JNK、p38 MAPK、NF-κB p65 mRNA表达显著降低,具有剂量依赖性(均P<0.05);与LPS+药物-H组相比,LPS+药物-H+Anisomycin组JNK、p38 MAPK、NF-κB p65 mRNA表达显著增加(均P<0.05)。见表6。

表6 各组细胞JNK、p38 MAPK、NF-κB p65 mRNA表达水平比较

2.7 八桂止痛散对LPS诱导的星形胶质细胞JNK/p38 MAPK/NF-κB p65通路相关蛋白表达的影响 与对照组相比,LPS组p-JNK/JNK、p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-NF-κB p65/NF-κB p65表达显著增加(均P<0.05);与LPS组相比,LPS+药物-L组、LPS+药物-M组、LPS+药物-H组p-JNK/JNK、p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-NF-κB p65/NF-κB p65表达显著降低,具有剂量依赖性(均P<0.05);与LPS+药物-H组相比,LPS+药物-H+Anisomycin组p-JNK/JNK、p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-NF-κB p65/NF-κB p65表达显著增加(均P<0.05)。见表7(图3)。

A:对照组;B:LPS组;C:LPS+药物-L组;D:LPS+药物-M组;E:LPS+药物-H组;F:LPS+药物-H+Anisomycin组图3 各组细胞JNK、p-JNK、p38 MAPK、p-p38 MAPK、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表达电泳图

表7 各组细胞p-JNK/JNK、p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-NF-κB p65/NF-κB p65表达比较

3 讨 论

神经病理性疼痛通常是由损伤和损害神经系统的疾病引起慢性疼痛综合征,以自发性疼痛、感觉异常、痛觉过敏为特点[7-8]。脊髓星形胶质细胞是中枢神经系统中的一种常驻免疫细胞,周围神经一旦损伤后,脊髓星形胶质细胞被激活并分泌大量炎症和神经递质介质,使神经元致敏,加重中枢致敏作用,在神经病理性疼痛发病机制中起着关键作用[8-9]。该疾病严重影响患者生活质量,但是由于目前对其发生机制了解不够深入,尚无有效治疗方法[10-11],因此需深入探索其机制以获取有效治疗药物。

神经病理性疼痛常见于脊髓损伤患者中,但目前抗炎、镇痛药物对该疾病的治疗具有极大抗性,故寻找有效治疗方案意义重大[12]。八桂止痛散主要由八角枫、透骨草、桂枝以及大黄等成分组成,其中大黄味苦,性寒,具有活血祛瘀、清热解毒、止血、泻火等功效,可发挥抗病毒、抗炎等作用[13];透骨草味辛、甘,具舒筋活络、祛风除湿特点,主要表现镇痛、抗炎的疗效,与大黄同为臣药[14-15];桂枝、八角枫其味辛、性温,其功效为温通经络、发汗解表,具有镇痛、解热、抗炎等作用[16-17];全方可发挥通络止痛、破气行血等功效[18]。本研究通过对药物浓度筛选,分别确定了八桂止痛散的低、中、高浓度,并进行后续实验探索;结果发现八桂止痛散可有效提高细胞存活率,抑制其凋亡,降低IL-1β、IL-6、TNF-α水平,具有剂量依赖性,表明八桂止痛散可通过降低炎症抑制LPS诱导的星形胶质细胞凋亡,提高细胞活力,有望在神经病理性疼痛中发挥作用。此外,八桂止痛散与八桂止痛膏成分相似,且已有文献报道,八桂止痛膏在带状疱疹后遗神经痛、二甲苯致小鼠耳廓肿胀实验中均表现出明显的抗炎、止痛效果[19-20],故推测八桂止痛散也具有相似药理作用。

MAPK是一种蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶,可通过蛋白质磷酸化调节转录和翻译,当MAPK家族被激活时,可激活脊髓背角小胶质细胞和星形胶质细胞活性,增加炎性因子的合成和释放,增强神经元的兴奋性、中枢敏化、兴奋性突触传递,引发痛觉过敏和异常性疼痛,因此MAPK通路与神经病理性疼痛息息相关[21-22]。MAPK被认为是启动NF-κB激活的经典途径,NF-κB的激活可能有助于促炎细胞因子分泌[23-24]。故推测JNK/p38 MAPK/NF-κB信号通路可能与神经病理性疼痛的发生相关。结果显示,LPS诱导的星形胶质细胞中,JNK/p38 MAPK/NF-κB信号通路被激活并释放炎性因子,提示激活JNK/p38 MAPK/NF-κB信号通路可能参与神经病理性疼痛发生发展。亥茅酚苷通过抑制JNK/p38 MAPK和NF-κB信号通路,使得促炎细胞因子减少,缓解了机械性异常性疼痛[25]。本研究发现八桂止痛散可抑制LPS诱导的脊髓星形胶质细胞中JNK/p38 MAPK/NF-κB信号通路激活,降低炎症反应及细胞凋亡,减轻脊髓星形胶质细胞受损。最后实验以通路抑制剂-Anisomycin进行反向验证,结果发现Anisomycin逆转了八桂止痛散对LPS诱导的脊髓星形胶质细胞保护作用,表明八桂止痛散可能通过抑制JNK/p38 MAPK/NF-κB信号通路发挥作用。

综上所述,八桂止痛散可抑制LPS诱导的脊髓星形胶质细胞凋亡,降低炎症反应,可能与抑制JNK/p38 MAPK/NF-κB信号通路有关。