微生物菌肥替代部分化肥对花椰菜产量、品质及土壤微生物的影响

侯 栋,李亚莉,岳宏忠,张东琴,姚 拓,黄书超,杨海兴

(1.甘肃省农业科学院 蔬菜研究所,甘肃 兰州 730070; 2.甘肃农业大学 草业学院,草业生态系统教育部重点实验室,甘肃 兰州 730070; 3.甘肃农业大学 园艺学院,甘肃 兰州 730070; 4.甘肃省榆中县农业技术推广中心,甘肃 榆中 730070)

蔬菜在我国居民饮食中占据重要地位,蔬菜生产是农民重要的经济来源和农业重要的经济支柱[1]。近年来,我国蔬菜产业发展迅速[2],但随着蔬菜栽培年限的增长和化肥的过量使用,一些蔬菜地的土壤理化性状恶化,引致蔬菜产品品质下降,硝酸盐和亚硝酸盐含量超标,严重制约蔬菜产业的可持续发展[3]。

微生物肥料,又称菌肥、生物肥料、微生物接种剂,是指含有有益微生物,以特定微生物的生命活动使作物获得肥效的微生物制品[4]。研究表明,微生物菌肥可能是替代化肥最具潜力的绿色肥料之一[5]。植物根际存在着促生菌(PGPR),这类菌大多数可以固定空气中的氮气,一些菌还兼具溶解土壤中不能被植物直接吸收利用的磷素、分泌植物生长调节物质(如生长素和赤霉素等)、促进植物根系生长和矿物质吸收、增强植物抗病性等功能[6]。利用从不同环境、不同植物根际分离筛选的优良促生菌研制的生物菌肥既具有肥效作用,还可以减少生产中因使用农药、化肥而带来的环境和食品污染及非再生能源消耗。于健等[7]研究发现,微生物菌肥部分替代化肥可显著提高番茄的产量和品质。岳宏忠等[8]研究发现,微生物菌剂与化肥配施能够在不减产的前提下提高土壤细菌多样性和土壤有益菌的相对丰度。蒋永梅等[9]研究表明,优良的PGPR菌株对青梗花椰菜的生长具有良好的促进效果。李杰等[10]用生物肥部分替代化肥,结果发现,减施20%化肥配施生物肥可在不影响花椰菜产量的同时,显著改善花椰菜的品质,提高肥料利用率和光合效率。李凤霞等[11]的研究也证实,微生物菌肥能够显著提高花椰菜的产量。

花椰菜具有很好的营养价值和经济价值,是甘肃省高原夏菜主要种植的蔬菜种类之一。本文在前期研究的基础上,以试验当地常用化肥施用量为基准,研究微生物肥源部分替代化肥对花椰菜生长、品质和产量的影响,以期为化肥减量、土壤保育和蔬菜品质提升提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试花椰菜品种为小米粒100,系青梗散花型花椰菜,由甘肃省农业科学院蔬菜研究所花椰菜课题组提供。

本试验采用垄膜沟灌栽培模式,定植前整地作畦,沟深20 cm,沟宽30 cm,垄宽40 cm。供试土壤的基本理化性状如下:pH值8.2,全盐量0.046%,有机质含量19.9 g·kg-1,碱解氮含量123.3 mg·kg-1,速效钾含量154.3 mg·kg-1,有效磷含量23.1 mg·kg-1,全磷含量0.8 mg·kg-1,全钾含量20.9 mg·kg-1,全氮含量1.4 mg·kg-1。

供施肥料系蔬菜专用硫基长效复合肥(N质量分数18%,P2O5质量分数16%,K2O质量分数14%),由甘肃省农业科学院土壤肥料与节水农业研究所研制。

微生物菌剂含4种PGPR菌株,有效活菌数≥108CFU·g-1,生产单位为甘肃鸿远生物技术有限公司。

1.2 试验设计

试验于2018年4月至2020年9月在甘肃省兰州市榆中县进行,共设3个处理:A,全量化肥(当地常规化肥施用量);B,菌肥(60 kg·hm-2)+60%化肥(即当地常规化肥施用量的60%);C,菌肥(120 kg·hm-2)+40%化肥(即当地常规化肥施用量的40%)。

本试验采用完全随机区组设计,每处理重复3次,每小区面积40 m2,每垄定植两行,株距为40 cm,其余田间管理均与当地传统方式保持一致。在当地花椰菜种植中,常规基施900 kg·hm-2的蔬菜专用硫基长效复合肥。

于2020年7月(花椰菜生长后期)在每个取样点采集2份土壤样品,去除表面杂物后,一部分新鲜土样保存于-80 ℃环境中,用于微生物多样性研究;另一部分自然风干后过1 mm筛,用于土壤理化性质和土壤酶活性的测定。

1.3 指标测定

1.3.1 花椰菜产量与品质指标测定

待产品器官达到采收标准后,每年每个处理的每次重复随机选取10株,测定花椰菜的单株重、叶球重、叶片重,统计小区产量,并折算单位面积(以1 hm2计)产量。同时,分别采用2,6-二氯靛酚法、烘干法、考马斯亮蓝法、蒽酮法、紫外分光光度法测定叶球的维生素C(VC)、粗纤维、可溶性蛋白、可溶性糖、硝酸盐含量[12]。

1.3.2 土壤样品采集

待3 a的定位试验结束后,用5点取样法采集试验小区0～20 cm土样[13]。采样器需经乙醇消毒后再取样,每个样点取3份土样作为重复,用于土壤微生物总DNA的提取、测序及土壤理化性质测定。

1.3.3 土壤理化性质测定

使用Hanna HI8314便携式pH仪[汉钠仪器(上海)有限公司]测定土壤pH值,浸提液的土水质量体积比为1∶5;使用雷磁DDSJ-308A电导仪[仪电科学仪器(上海)有限公司]测定土壤电导率(EC,单位为mS·cm-1),并相应折算全盐量(全盐量的单位为%,当EC值≤3时,全盐量的值约等于EC值的0.320;当EC值>3时,全盐量的值约等于EC值的0.355)。参照文献[14-16]中的方法,测定下列指标,简述如下:采用重铬酸钾容量-稀释热法测定土壤有机质含量,采用碱解扩散法测定土壤碱解氮含量,采用碳酸氢钠浸提-钼锑抗比色法测定土壤有效磷含量,采用 NaNO3浸提-四苯硼钠比浊法测定土壤速效钾含量,采用半微量凯氏法测定土壤全氮含量,采用氢氧化钠熔融—钼锑抗比色法测定土壤全磷含量,采用氢氧化钠熔融—火焰光度法测定土壤全钾含量。土壤脲酶活性用靛酚蓝比色法测定;过氧化氢酶活性用高锰酸钾滴定法测定;碱性磷酸酶活性用磷酸苯二钠比色法测定;蔗糖酶活性用3,5-二硝基水杨酸比色法测定[12]。

1.3.4 土壤微生物总DNA的提取与测序

将保存的土样交由上海联川生物技术公司进行土壤微生物总DNA的提取与测序。简述如下:采用E.Z.N.A.®Soil DNA Kit试剂盒(上海索莱宝生物科技有限公司),按照说明书方法获得土壤总DNA,经琼脂糖电泳检查DNA的完整性,并测定其含量,选择合格样品用于测序。对于细菌,选择其16S rDNA的V3～V4区域,采用引物341F (5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′)和805R(5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′)进行PCR扩增[17];对于真菌,选择ITS2可变区,采用引物ITS1(5′-GTGARTCATCGAATCTTTG-3′)和ITS2(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)进行PCR扩增[18]。PCR产物经纯化[AxyPrep PCR Cleanup Kit回收试剂盒,康宁生命科学(吴江)有限公司]、定量后,准备扩增子库进行测序。采用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit试剂盒在Qubit荧光定量系统上对文库进行定量。构建好的文库使用Illumina NovaSeq测序系统进行2×250 bp 的双端测序。利用QIIME2软件计算α-多样性,并基于Chao1指数、Shannon指数、Simpson指数进行处理间的比较。

1.4 数据处理

样品在Illumina NovaSeq平台上进行测序。对测序结果,利用QIIME2插件特征分类器进行物种标注序列比对,用于比对的数据库为SILVA和UNITE。

采用SPSS 26软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA),对有显著(P<0.05)差异的,采用最小显著差数法(LSD)进行多重比较,以评价不同处理对花椰菜品质、产量及土壤理化性质的影响。采用Microsoft Excel 2007软件绘图。

2 结果与分析

2.1 微生物菌肥替代化肥对花椰菜产量和品质的影响

在2018年和2020年,B处理的产量最高(表1),分别达到了32.41、33.61 t·hm-2,显著高于同年的其他处理,较A处理分别提高了7.7%和2.1%;在2019年,A处理的产量最高,达到了48.67 t·hm-2,其次是B处理和C处理,三者差异均显著。

表1 不同处理对花椰菜品质和产量的影响Table 1 Effect of treatments on quality and yield of cauliflower

对比各处理花椰菜的品质指标:在2018年,各处理间在检测的品质指标上均无显著差异。在2019年,与A处理相比,B处理和C处理的VC含量分别显著提高了72.2%和94.3%;C处理的粗纤维、可溶性蛋白、硝酸盐含量分别显著降低了7.6%、29.8%、5.6%;B处理的硝酸盐含量显著升高了6.4%。在2020年,与A处理相比,C处理的VC含量显著降低了4.2%;B处理的粗纤维含量显著提高了37.7%,而硝酸盐含量显著降低了7.0%。总的来看,利用微生物菌剂替代40%的化肥对花椰菜的花球品质并无明显不良影响。

2.2 微生物菌肥替代化肥对土壤理化性质和酶活性的影响

经过3 a的定位试验,与A处理相比,B、C处理的土壤脲酶、过氧化氢酶和碱性磷酸酶活性,及pH值、全盐量、有机质含量、碱解氮含量、全氮含量、全钾含量无显著差异(表2、表3);B、C处理的土壤蔗糖酶活性和有效磷含量显著升高;C处理的土壤速效钾含量显著下降,而全磷含量显著升高。以上结果说明,微生物菌肥可替代部分化肥,且在提高土壤质量方面有一定的效果。

表2 不同处理对土壤酶活性的影响Table 2 Effect of treatments on soil enzymes activities

表3 不同处理对土壤基本理化性质的影响Table 3 Effect of treatments on soil physiochemical properties

2.3 微生物菌肥替代化肥对土壤微生物的影响

表征微生物物种丰富度的Chao1指数,及表征微生物群落多样性的Shannon指数和Simpson指数,在各处理间差异不显著(表4、表5)。

表4 不同处理对土壤细菌α多样性的影响Table 4 Effect of treatments on α-diversity of soil bacteria

表5 不同处理对土壤真菌α多样性的影响Table 5 Effect of treatments on α-diversity of soil fungi

对于土壤细菌而言,在门水平上,各处理的细菌群落组成相似(图1),相对丰度>1%的门有12个,合计约占全部细菌丰度的96.66%～96.86%,其中,变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteriota)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)为优势门,相对丰度大于10%。相较于A处理,施用微生物菌肥后(对应于B、C处理),土壤中固氮菌的相对丰度提高,与土壤N素循环有关的浮霉菌门(Planctomycetota)的相对丰度提高了17.0%～18.5%,具有硝化作用的硝化螺旋菌门(Nitrospirae)的相对丰度降低了11.7%～16.4%;同时,土壤中有益菌的相对丰度也增高,放线菌门(Actinobacteria,其次生代谢产物可拮抗病原菌)的相对丰度提升0～24.9%,厚壁菌门(Firmicutes,大多数具有防控生物病害的功能)的相对丰度提升了4.4%～29.2%。在属水平上,微生物菌肥可使土壤中WD2101_soil_group_unclassified、RB41这2个属的相对丰富度增加(图2),可降低Gemmatimonadaceae_unclassified、芽单胞菌属(Gemmatimonas)、硝化螺菌属(Nitrospira)的相对丰度。芽单胞菌属是有机碳(苯酚)分解的主要细菌,其相对丰度的降低或许与土壤有机质含量的降低相关。

图1 不同处理门水平上的土壤细菌(左)、真菌(右)相对丰度Fig.1 Relative abundance of soil bacteria (left) and fungi (right) at phyla level under treatments

图2 不同处理属水平上的土壤细菌(左)、真菌(右)相对丰度Fig.2 Relative abundance of soil bacteria (left) and fungi (right) at genus level under treatments

对于土壤真菌而言,不同处理的土壤真菌类群组成整体相似,相对丰度大于1%的除未分类真菌(Fungi_unclassified)外,包括子囊菌门(Ascomycota)、油壶菌门(Olpidiomycota)、接合菌门(Zygomycota)、担子菌门(Basidiomycota)和壶菌门(Chytridiomycota),合计占全部真菌相对丰度的99.87%～99.98%。施用微生物菌肥后,较全量化肥(A处理)而言,子囊菌门、接合菌门的相对丰度有所提高,增幅分别为8.90%～14.43%、23.01%～28.79%,油壶菌门、担子菌门、壶菌门的相对丰度降低,降幅分别为2.98%～42.97%、14.73%～19.55%、65.99%～73.91%。在属水平上,相对丰度>10%的优势属除未分类真菌(Fungi_unclassified)外,还有油壶菌属(Olpidium)、被孢霉属(Mortierella),相对丰度分别为11.44%～20.06%、13.80%～17.83%。施用微生物菌肥较全量化肥降低了油壶菌属和小壶菌属(Spizellomyces)这两类病原菌的相对丰度,降幅分别为2.98%～42.97%、80.69%～85.31%,提高了被孢霉属有益微生物的相对丰度,增幅为29.20%～23.49%,使土壤真菌群落组成更有利于花椰菜生长。

2.4 花椰菜产量、品质指标与土壤因子的相关性

相关性分析结果显示,土壤pH和全氮含量与产量呈显著正相关(表6),土壤全磷含量和放线菌门相对丰度与VC含量呈显著负相关,土壤酸杆菌门相对丰度与粗纤维含量呈显著正相关,子囊菌门相对丰度与可溶性糖含量呈显著正相关。其他土壤因子与花椰菜产量、品质指标间无显著相关性。

表6 花椰菜产量、品质指标与土壤因子的相关性Table 6 Correlation within cauliflower yield and quality indexes and soil factors

3 讨论

3.1 减量化肥配施微生物菌剂对花椰菜产量和品质的影响

花椰菜作为一种具有保健功能的蔬菜,深受广大消费者的喜爱。目前,我国是世界上花椰菜种植面积最大、总产量最高的国家[19]。花椰菜的营养价值丰富,其VC含量是番茄的8倍、芹菜的15倍[20]。近年来,由于农民盲目追求产量,过量施用化肥的现象频发,导致蔬菜连作时的产量和品质逐渐下降,不利于蔬菜产业的长久健康发展[21-23]。微生物菌肥不仅可以促进黄瓜的营养生长[24],还可提高番茄果实中维生素C、可溶性糖的含量和果实产量[25-26]。本研究结果与前人研究相似,适宜量的微生物菌肥与化肥配施(60 kg·hm-2菌肥+60%化肥)有助于花椰菜产量的提升,这可能是因为微生物菌肥中富含的多种促生菌可以有效促进作物对土壤养分的吸收和转化;但当微生物菌肥用量过大,而配施的化肥比例较低时,作物所能利用的土壤养分含量降低,亦会导致作物品质和产量的下降[27-29],如本研究中120 k·hm-2菌肥+40%化肥处理就导致花椰菜的产量显著降低。

在花椰菜品质方面,减量化肥配施菌肥主要影响花球的VC、粗纤维、可溶性蛋白和硝酸盐含量,在2019年,施用菌肥的B、C处理的花球VC含量较A处理显著升高,在2020年,60 kg·hm-2菌肥+60%化肥处理的花球VC含量仍处于较高水平,与A处理无显著差异,但显著高于120 kg·hm-2菌肥+40%化肥的处理。同时,60 kg·hm-2菌肥+60%化肥处理的花椰菜花球在2020年的硝酸盐含量显著低于其他处理。

3.2 减量化肥配施微生物菌剂对土壤理化性质和酶活性的影响

土壤理化性质和酶活性是反映土壤质量的重要指标[30]。有研究指出,长期施用化肥通常会引起土壤盐渍化、土壤板结、透气性变差等问题[31]。长期施用微生物菌肥有利于改善土壤质量,但在短期内可能无法发挥显著的效果[32]。本研究中,60 kg·hm-2菌肥+60%化肥处理较全量化肥的处理显著提高了土壤的有效磷含量。这可能是由于微生物菌剂所含的促生菌具有转化有机磷的特性,因而有助于增加土壤养分[31]。本研究中,60 kg·hm-2菌肥+60%化肥处理的土壤蔗糖酶活性显著高于单施化肥的处理,这与张绪美等[33]的研究结果相似;但各处理的土壤脲酶、碱性磷酸酶和过氧化氢酶活性无显著差异。徐忠山等[34]的研究发现,BMF菌肥和MF菌肥的施用均抑制了茶园土壤脲酶的活性,这可能与作物种类、土壤类型、菌肥配施比例及田间管理措施的差异有关。

3.3 减量化肥配施微生物菌剂对土壤微生物的影响

钱海燕等[35]研究表明,秸秆还田配施化肥及微生物菌剂刺激了微生物的生长和活动,细菌与真菌数量明显增多。李凤霞等[11]的研究表明,化肥配施微生物菌剂可以有效提高土壤中的细菌数量,降低真菌数量,并且配合减量化肥的效果相比全量化肥更优。刘森林[36]研究发现,两种菌剂(BS和EM)及有机肥对土壤微生物群落组成有不同程度的影响,但均能抑制部分植物病原细菌和真菌。Li等[37]对花生根际微生物的研究发现,病原菌的增多是以有益微生物的减少作为前提的。本研究中,微生物菌剂部分替代化肥后,有益微生物(如放线菌门、厚壁菌门等)的相对丰度增加,而有害微生物(如油壶菌属和小壶菌属)的相对丰度降低。我们推测,这主要是由于微生物菌剂所含的促生菌具有与植物联合固氮、溶解土壤难溶性磷、转化有机磷、分泌植物生长激素和拮抗引起植物病害的病原菌等特性,能够优化土壤微生物群落结构,使土壤向着更利于植物生长的方向转变。微生物菌肥不仅能够给土壤提供养分,而且能够优化调控土壤微生物菌群区系结构,促进根际土壤PGPR菌增殖,进而提高作物的产量与品质[38]。

综上所述,适宜用量的微生物菌肥部分替代化肥可提高土壤质量、改变土壤微生物群落结构、平衡微生物区系,改善高原种植区花椰菜的品质,在本试验条件下,以60 kg·hm-2菌肥配施540 kg·hm-2蔬菜专用硫基长效复合肥(减少化肥用量40%)处理的效果最佳。