施用侧孢短芽孢杆菌对烤后烟叶钾含量及烟株生理特征的影响

宋 鹏,李理想,江厚龙,王 茹,李 慧,赵鹏宇,张 均,*,秦平伟,任江波,陈庆明

(1.河南科技大学 农学院,河南 洛阳 471023; 2.重庆烟草科学研究所,重庆 400715; 3.重庆市烟草公司 彭水县分公司,重庆 409600)

烟草是嗜钾类作物,充足的钾素供应可增强卷烟的色泽、燃烧性和持火力[1];因此,烟叶中的钾含量也常被用作衡量烟叶品质的重要指标之一[2]。炭疽病、气候斑病等病害直接影响烟叶的品质与经济效益。有研究表明,钾元素与烟株的抗逆能力关系密切[3],增施钾肥可通过提高作物的抗病性[4-5]进而提高烟叶的品质和经济效益[6-7]。

目前,提高烟叶钾含量的途径主要包括应用钾高效品种、增加钾肥施用量、优化肥料配方和钾肥施用方法与时间等[8-10]。然而,施入土壤的钾肥大部分易被土壤固定或随水淋失,既导致钾肥利用率下降,又造成钾肥资源的浪费[11-12]。近年来,人们尝试用生物菌剂的方法来提高作物钾含量。侧孢短芽孢杆菌(Brevibacilluslaterosporus)是一种好氧的产孢细菌[13],具有可抑制多种病虫害、培养周期短、生产方便等特点,是常见的生防菌之一[14-15]。研究表明,芽孢杆菌具有解钾[16]、促生[17]、降解污染物[18]等多种功能,施用芽孢杆菌可改善作物根区土壤的微生物群落结构[19]。然而,关于施用侧孢短芽孢杆菌对烟株钾含量、抗病性的影响及其生理机制的研究还鲜见报道。为此,本研究以烟草品种K326为试验材料,在烟草移栽期施用侧孢短芽孢杆菌,研究不同施用方式对烤后烟叶钾含量及叶片抗病性、光合色素含量、抗逆生理指标的影响,探究侧孢短芽孢杆菌的最佳施用方式,旨在为烟草种植过程中微生物制剂的应用提供理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验在重庆市彭水苗族土家族自治县龙塘乡双星村(29°08′73″N,108°00′65″E)烟田进行。试验地肥力中等,条件良好,土壤pH值为5.58,有机质、全氮含量分别为21.0、0.97 g·kg-1,碱解氮、速效磷、速效钾含量分别为85.7、8.39、145.7 mg·kg-1。当地属亚热带季风气候,多年平均气温14.5 ℃,年平均降水量1 200 mm。

1.2 试验材料与仪器

供试烟草品种为K326,由重庆市烟草公司彭水县分公司提供。供试微生物菌株为侧孢短芽孢杆菌HA-2(CGMCC编号24130),经发酵、离心浓缩、喷雾干燥制备菌粉,有效活菌数约为8×1010CFU·g-1,由河南科技大学农学院特色生物资源开发与利用实验室提供。

UV-2600i紫外可见分光光度计,日本Shimadzu;Gr36石墨消解仪,上海晟声自动化分析仪器有限公司;FP640火焰光度计,上海精密仪器仪表有限公司;Forma 88700V超低温冰箱,美国Thermo Fisher;5810R高速冷冻离心机,德国Eppendorf;MGC-450光照培养箱,郑州生元仪器有限公司。

1.3 试验设计

采用单因素试验设计,设置4个处理,每个处理重复3次,共计12个小区,每个小区4行,株距50 cm,行距1.2 m,四周设置保护行。2021年4月27日在烟草移栽期按照各处理的设计开展试验:T1(对照),不施用侧孢短芽孢杆菌;T2(浸根处理),将烟苗根部放入侧孢短芽孢杆菌稀释液(1 g·L-1)中浸根4 h,之后移栽覆土;T3(灌根处理),烟苗移栽后,在烟苗根部半径5 cm范围内均匀灌入100 mL质量浓度为1 g·L-1的侧孢短芽孢杆菌稀释液;T4(浸根+灌根),移栽前,将烟苗根部放入侧孢短芽孢杆菌稀释液(1 g·L-1)中浸根4 h,烟苗移栽后,在烟苗根部半径5 cm范围内均匀灌入100 mL质量浓度为1 g·L-1的侧孢短芽孢杆菌稀释液。

各处理除侧孢短芽孢杆菌的施用方式不同外,其余田间栽培管理措施均按当地优质烟叶生产的标准执行。从2021年7月5日第一次烟叶达到成熟采烤水平至2021年8月26日采烤完成,共采收5次。

1.4 指标测定

分别在烤烟移栽后30 d(团棵期)、60 d(旺长期)、90 d(成熟期)在每个处理小区取代表性烤烟5株,用剪刀剪取叶片,采用丙酮法测定新鲜烟叶的叶绿素和类胡萝卜素含量,采用氮蓝四唑光化还原法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性,采用愈创木酚法测定过氧化物酶(POD)活性,采用硫代巴比妥酸显色法测定丙二醛(MDA)含量。上述指标均以鲜重计。

分别在烤烟移栽后的30、60、90 d,在每个小区取5株代表性烤烟的根系,105 ℃杀青,68 ℃烘至质量恒定,备用。于采收结束时,取烤后上部烟叶(B2F)、中部烟叶(C3F)各2.5 kg,备用。将上述样品粉碎,过20目筛,用火焰光度计法测定钾含量。

烤烟移栽后60 d,依据国家标准GB/T 23222—2008《烟草病虫害分级及调查方法》,田间调查供试烟株气候斑病、炭疽病、赤星病和叶斑病的发生情况,计算发病率与病情指数。

1.5 数据处理

采用Excel 2019软件整理数据,采用SPSS 22.0软件进行方差分析,对有显著(P<0.05)差异的,采用Duncan法进行多重比较。用Origin 2018软件制图。

2 结果与分析

2.1 施用侧孢短芽孢杆菌对烟株钾含量的影响

各处理烟株根系的钾含量随时间推进表现出逐渐降低的趋势(图1)。移栽30 d时,T4处理烟株根系钾含量达到测定时段内的最大值(2.89%),显著高于其他处理,较T1增加16.58%,T1、T2、T3处理间无显著差异;移栽60 d时,T2、T3处理烟株根系钾含量与T1、T4处理的差异均不显著,T4处理烟株根系钾含量较T1显著增加18.88%;移栽90 d时,T2、T3、T4处理烟株根系钾含量较T1分别显著增加39.98%、38.20%和28.85%。综上,施用侧孢短芽孢杆菌可提高烟株根系的钾含量,总的来看,以浸根+灌根的施用方式整体表现最佳,单独浸根或灌根的施用方式对根系钾含量的影响主要表现在中后期。

同一时间柱上无相同字母的表示处理间差异显著(P<0.05)。下同。Bars marked without the same letters indicate significant difference between treatments at P<0.05 on the same day. The same as below.图1 不同处理对烟株根系钾含量的影响Fig.1 Effect of treatments on potassium content in tobacco root

施用侧孢短芽孢杆菌可提高烤后烟叶的钾含量(图2)。T2处理烤后上部叶、中部叶的钾含量与T1均无显著差异;T3处理烤后上部叶的钾含量较T1显著提高29.77%,中部叶的钾含量与T1无显著差异;T4处理烤后上部叶和中部叶的钾含量分别较T1显著提高29.86%、67.36%。不同施用方式下作用效果的差异可能与侧孢短芽孢杆菌在根系中的定殖状况、作用时效有关。

图2 不同处理对烤后烟叶钾含量的影响Fig.2 Effect of treatments on potassium content in cured tobacco leaves

总的来看,浸根+灌根的处理较单独灌根或浸根的处理更利于提高烤后烟叶的钾含量。

2.2 施用侧孢短芽孢杆菌对烤烟抗病性的影响

移栽60 d,施用侧孢短芽孢杆菌处理的烟株气候斑病、炭疽病、赤星病和叶斑病的发病率均较T1处理显著下降(表1)。在这几种病害中,气候斑病的发病率最高,叶斑病的发病率最低。与T1处理相比:T2、T3、T4处理气候斑病的发病率分别下降2.60、3.01、4.32百分点,T4处理气候斑病的病情指数显著降低;T2、T3、T4处理炭疽病的发病率分别下降0.76、1.17、2.11百分点,T4处理炭疽病的病情指数显著降低;T2、T3、T4处理赤星病的发病率分别下降1.43、1.82、4.08百分点,T2、T3、T4处理赤星病的病情指数显著降低,且T4处理赤星病的病情指数还显著低于T2和T3处理;T2、T3、T4处理叶斑病的发病率分别下降2.87、2.53、3.24百分点,T2、T3、T4处理叶斑病的病情指数显著降低。总的来看,T4处理下烟株对上述各种病害的抗病性最好。

表1 不同处理对烟株抗病性的影响Table 1 Effects of treatments on disease resistance of tobacco

2.3 施用侧孢短芽孢杆菌对烟叶光合色素的影响

移栽30～90 d时,各处理烟叶的叶绿素含量呈现出先升高后降低的趋势(图3),在移栽60 d时达到测定时段内各处理下的最大值。移栽30 d时,T4处理烟叶的叶绿素含量较T1处理显著提高16.39%,T2、T3处理烟叶的叶绿素含量与T1、T4处理均无显著差异;移栽60 d时,T2、T3、T4处理烟叶的叶绿素含量较T1显著提高8.48%～13.21%,且T4处理烟叶的叶绿素含量还显著高于T2;移栽90 d时,T2、T3、T4处理烟叶的叶绿素含量同样较T1显著提高,其中,T4处理烟叶的叶绿素含量较T1处理显著提高18.81%。综上,浸根+灌根的处理可显著提高移栽30～90 d内烟叶的叶绿素含量。

图3 不同处理对烟叶叶绿素含量的影响Fig.3 Effect of treatments on chlorophyll content in tobacco leaves

移栽30～90 d时,各处理烟叶的类胡萝卜素含量同样表现出先升后降的趋势(图4)。移栽30 d时,T2、T3、T4处理烟叶的类胡萝卜素含量较T1显著提高10.49%～22.84%。移栽60 d时,T4处理烟叶的类胡萝卜素含量最高,较T1处理显著提高21.01%;T2处理烟叶的类胡萝卜素含量与T1无显著差异。移栽90 d时,T2、T3、T4处理烟叶的类胡萝卜素含量均较T1显著提高,且以T4处理烟叶的类胡萝卜素含量最高,较T1处理显著提高35.41%。综上,浸根+灌根的施用方式最利于提高烟叶的类胡萝卜素含量。

图4 不同处理对烟叶类胡萝卜素含量的影响Fig.4 Effect of treatments on carotenoid content in tobacco leaves

2.4 施用侧孢短芽孢杆菌对烟叶抗氧化酶活性及MDA含量的影响

移栽30 d时,T4处理烟叶的SOD活性较T1处理显著提高9.63%(图5),但其余处理间无显著差异。随着生育时期推进,烟叶的SOD活性逐渐增高,处理间的差异越大。移栽60、90 d时,T2、T3、T4处理烟叶的SOD活性均显著高于T1,且以T4处理烟叶的SOD活性最高,分别较T1处理显著增加14.44%、18.31%。

图5 不同处理对烟叶超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响Fig.5 Effect of treatments on superoxide dismutase (SOD) activity in tobacco leaves

测定期内,各处理烟叶的POD活性随时间推进呈逐渐升高的趋势(图6)。移栽30、60 d时,仅T4处理烟叶的POD活性显著高于T1,增幅分别为11.62%、12.17%。移栽90 d时,T2、T3、T4处理烟叶的POD活性较T1处理显著增加4.87%～13.81%,以T4处理烟叶的POD活性最高,且显著高于T2处理。总的来看,测定期内T4处理烟叶的POD活性始终最高,说明该施用方式提升烟叶POD活性的效果最佳。

图6 不同处理对烟叶过氧化物酶(POD)活性的影响Fig.6 Effect of treatments on peroxidase (POD) activity in tobacco leaves

移栽30～90 d,烟叶的MDA含量随时间推进总体呈递增趋势(图7),且各时期都以T1处理烟叶的MDA含量最高。移栽30 d时,T2处理烟叶的MDA含量与T1无显著差异,T4处理烟叶的MDA含量较T1处理显著降低30.99%。移栽60 d时,T2、T3、T4处理烟叶的MDA含量均显著低于T1,且以T4处理最低,较T1处理显著降低29.39%。移栽90 d时,T2、T3、T4处理叶片的MDA含量分别较T1显著降低9.45%、14.47%、20.76%,且T4处理叶片的MDA含量还显著低于T2和T3处理。总的来看,施用侧孢短芽孢杆菌可降低叶片的MDA含量,单独采用浸根或灌根方式的效果无显著差异,浸根+灌根处理的效果最佳。

3 讨论

提高烟叶钾含量有利于提升烤烟品质[20]。为了实现烟叶增钾提质的目标,生产上已广泛采用增施钾肥、优化施钾方式、增加追肥次数[21-22]等措施,并导致钾肥过量施用、资源浪费和用工成本增加等问题[23]。研究发现,芽孢杆菌是一种典型的根际促生菌,侧孢短芽孢杆菌具有解钾的功能,同时具有防病及促生作用。刘芳等[24]研究表明,微生物菌剂配施腐殖酸钾可显著增加土壤的速效钾含量,提高作物钾含量。芽孢杆菌与烟株根际的解钾细菌具有亲和性[25],施用侧孢短芽孢杆菌可在干旱条件下促进玉米钾累积,提高其抗旱性与产量[17]。烟株中上部叶的钾含量偏低,多与生育后期土壤供钾不足、根系吸收减少有关[26]。本研究发现,施用侧孢短芽孢杆菌可促进根系钾吸收,提高根系钾含量,显著提高烤后烟中上部叶的钾含量,其中,以浸根+灌根方式的效果最佳,但与灌根方式相比,二者上部叶的钾含量差异不显著,这可能是由于虽然浸根+灌根处理增加了根系及中部叶的钾含量,但由于生物竞争,上部叶获得的钾素来源少,因而效果不及中部明显。

在当前的烟叶生产中,由于烟田土壤微生物结构破坏、土壤酶活性降低及作物抗性下降,病害频繁发生,严重影响烟叶的产量、品质和种植效益[27]。侧孢短芽孢杆菌可产生多种抗菌物质,对植物病原真菌及细菌均有一定的抑制作用[28],可以预防番茄青枯病的发生[29],对烟草黑胫病菌也具有抑制作用[30]。本研究发现,施用侧孢短芽孢杆菌可提高烟株的钾含量,提高其对气候斑病、炭疽病、赤星病和叶斑病的抗性。这与董艳等[31]的研究结果相似。不同施用方式相比,以浸根+灌根的效果最佳。

作物的养分吸收利用和抗病性均与其抗逆能力有关。光合作用可间接反映作物的长势与抗逆性[32]。叶绿素a、b分别是光反应的中心色素分子和捕光色素分子,类胡萝卜素是内源抗氧化剂,可淬灭活性氧,防止细胞膜脂过氧化[33]。作物体内的SOD和POD可维持活性氧平衡、清除H2O2,保持细胞膜稳定性[34-35],而MDA的大量积累会对细胞膜和细胞造成伤害,引起植物生长发育受阻[36]。改善作物抗逆能力,提高SOD、POD活性,有利于降低其膜脂过氧化程度,提高作物的抗逆能力。施用微生物菌剂可改善作物的土壤环境,提高土壤微生物数量[37],进而促进作物叶绿素荧光参数的提高,增强其对有效光的利用[38-40]。苏煜等[41]研究发现,增施枯草芽孢杆菌可显著提升烤烟的光合作用效率,强化碳代谢。肖雨沁等[42]研究表明,施用侧孢短芽孢杆菌可显著提高烟苗的SOD、POD和过氧化氢酶(CAT)活性,降低MDA含量,促进烟苗根系发育,培育壮苗,提升烟叶品质。本研究发现,科学施用侧孢短芽孢杆菌可显著提高叶片的光合色素含量和抗氧化酶活性,降低MDA含量,从而提高烟草的抗逆能力。

综上,本研究以不施用侧孢短芽孢杆菌作为对照,研究浸根、灌根及浸根+灌根对烟草钾含量、抗病性及叶片生理特征的影响。结果表明,以浸根+灌根的方式施用侧孢短芽孢杆菌可以提高烤后烟叶的钾含量,提高叶片光合色素含量,及SOD、POD活性,降低MDA含量,增强烟株对气候斑病、炭疽病、赤星病和叶斑病的抗性。研究结果可为烤烟的优质生产提供新的思路和参考。