古今千金黄连丸中两种降糖成分的含量测定*

毛海龙,保瑞,万萧,闫鸿丽

(云南中医药大学1.中药学院;2.中药学院暨云南省南药可持续利用研究重点实验室,昆明 650500)

千金黄连丸出自《备急千金要方·卷第二十一·消渴第一》,书中写到“黄连一斤,生地黄一斤。右二味,绞地黄汁,浸黄连,出曝之燥,复纳之,令汁尽干之,捣末,蜜丸如梧子。服二十丸,日三,食前后无拘”。后《外台》卷十一引《肘后方》写到“黄连一斤(去毛),生地黄十斤,上为末,绞生地黄取汁,渍黄连,出,晒之燥,复纳之,令汁尽干,为末,炼蜜为丸,如梧桐子大”。两者不同之处在于前者地黄为一斤,后者为十斤。方中黄连为君,苦寒,具有泻火解毒之功;生地为臣,味甘、苦,性寒,能够养阴生津。二药相须配伍,具有养阴清热、生津止渴的功效,能够治疗阴虚燥热而致的消渴,尤其善治疗上消[1-3]。

现代研究表明,千金黄连丸具有较好的降糖效果,可用于糖尿病的治疗[4-6]。目前临床上治疗糖尿病的西药都以降糖为目的,治疗相对单一,并且长期使用可能会出现胰岛素抵抗和失效等问题,还可能发生低血糖、消化道反应、肝肾功能损坏等多种不良反应[7-9]。治疗糖尿病的药物开发需求仍然比较迫切,而现今单靶点降糖药物开发也遭遇瓶颈期,因而在传统药物特别是经典名方的基础上开发中药多靶点糖尿病治疗药物已成为研究热点。但如今千金黄连丸的研究多采用水煎法,并且使用生地黄,对该方的研究并未忠于原方,古法制备与现代制备是否会与原方功效存在差异这一问题,缺乏系统深入的针对性研究。研究表明黄连中小檗碱和黄连碱是其发挥降糖作用的主要成分,而巴马汀和表小檗碱在治疗糖尿病方面具有协同作用[10-12]。地黄中梓醇为主要降糖成分[13-15]。笔者目前未见关于同时测定古今千金黄连丸中生物碱和梓醇的报道,故本文采用高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)法测定古法与现代制备的1：1和1：10千金黄连丸中生物碱(表小檗碱、黄连碱、 巴马汀、小檗碱)和梓醇的含量,具有创新性,并比较其含量差异,为后续探究其药效差异奠定基础。同时也是为经典名方的研究提供一种新思路。

1 仪器与试药

1.1仪器 Waters e2695型高效液相色谱(美国Waters公司);EX125DZH型电子分析天平(奥豪斯仪器有限公司,感量:0.01 mg);JA2003N型电子天平(上海青海仪器有限公司,感量:0.1 mg);N1200BDOSB2100旋转蒸发仪(上海泉杰仪器有限公司);SK2510HP超声波清洗仪(上海科导超声仪器有限公司)。

1.2试药 黄连、生地黄购买于云南省昆明市螺蛳湾药材批发市场,鲜地黄购买地为河南焦作,经云南中医药大学中药学院生药教研室古今老师鉴定,黄连为毛茛科植物黄连CoptischinensisFranch.的干燥根茎,生地黄为玄参科植物地黄RehmanniaglutinosaLibosch.的干燥块根,鲜地黄为玄参科植物地黄RehmanniaglutinosaLibosch.的新鲜块根;表小檗碱(批号:20092104,含量:98.11%)、黄连碱(批号:20052005,含量:93.08%)、盐酸小檗碱(批号:19050604,含量:94.08%)、梓醇(批号:21092702,含量:96.49%)对照品(森岚科技有限公司);巴马汀对照品(成都普菲德生物技术有限公司,批号:21070705,含量:99.66%);磷酸二氢钾(批号:7778770,含量:99.50%)、十二烷基硫酸钠(批号:151213,含量:99.00%)(北京百灵威科技有限公司);甲醇、乙腈均为色谱纯(默克股份联合公司);其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1色谱条件

2.1.1梓醇的色谱条件 色谱柱:RD-C18柱(250 mm×4.0 mm,5 μm);流动相:甲醇-0.1%磷酸溶液(1：99);流速:1 mL·min-1;柱温:30 ℃;检测波长:210 nm;进样量:10 μL;进样时间:20 min。

2.1.2生物碱的色谱条件 色谱柱:RD-C18柱(250 mm×4.0 mm,5 μm);流动相:乙腈-0.05 mol·L-1磷酸二氢钾溶液(50：50)(每100 毫升中加十二烷基硫酸钠0.4 g,再以磷酸调pH值为4.0);流速:1 mL·min-1;柱温:30 ℃;检测波长:345 nm;进样量:10 μL;进样时间:30 min。

2.2对照品溶液的制备

2.2.1梓醇对照品溶液的制备 取适量梓醇对照品,精密称定,置于10 mL量瓶中,加入甲醇：水(20：80)定容,超声30 min使其溶解,制成浓度为0.45 mg·mL-1的对照品溶液。经孔径0.45 μm有机滤膜滤过,即得梓醇对照品储备液,于4 ℃冰箱中保存备用。

2.2.2生物碱对照品溶液的制备 取表小檗碱、盐酸黄连碱、巴马汀、盐酸小檗碱4个生物碱的对照品适量,精密称定,分别置于10 mL量瓶中,加入甲醇定容,超声30 min使其溶解,制成浓度分别为0.48、0.48、0.49、0.50 mg·mL-1的对照品溶液。经孔径0.45 μm有机滤膜滤过,即得各生物碱对照品储备液,于4 ℃冰箱中保存备用。

分别取表小檗碱、盐酸黄连碱、巴马汀、盐酸小檗碱的对照品储备液,2、2、2、4 mL,置于10 mL量瓶中,混匀,制成浓度分别为0.096、0.096、0.098、0.20 mg·mL-1的生物碱混合对照品储备液,于4 ℃冰箱中保存备用。

2.3供试品溶液的制备

2.3.1黄连供试品的制备 取黄连粉末0.2 g,用适量甲醇：水(20：80)超声溶解,充分摇匀,滤过,即得梓醇条件样品溶液;同上使用甲醇：盐酸(100：1)溶解,即得生物碱条件样品溶液。

2.3.2鲜地黄汁供试品的制备 取鲜地黄榨汁,取鲜地黄汁适量,离心,精密量取上清液2 mL,精密量取甲醇8 mL加入,超声10 min,静置30 min,离心,取上清液5 mL,60 ℃水浴挥干,加甲醇：水(20：80)定容至5 mL,摇匀,即得梓醇条件样品溶液;同上使用甲醇：盐酸(100：1)溶解,即得生物碱条件样品溶液。

2.3.3黄连水煎液供试品的制备 取干燥至恒重的黄连饮片5 g,加入10倍量的纯净水,煎煮1 h后用4层100目纱布趁热过滤残渣,收集煎液,残渣同法再继续煎煮2次,弃去残渣,合并3次煎液,制得黄连水煎液,煎液于60 ℃减压浓缩成浸膏,使用适量甲醇：水(20：80)超声溶解,充分摇匀,过滤,即得梓醇条件样品溶液;同上使用甲醇：盐酸(100：1)溶解,即得生物碱条件样品溶液。

2.3.4生地黄水煎液供试品的制备 取干燥至恒重的生地黄饮片5 g,制备方法同“2.3.3节”。

2.3.5古法千金黄连丸供试品溶液的制备 取适量的黄连粉末,再分别取1倍、10倍量鲜地黄榨汁,用鲜地黄汁浸泡黄连,置于太阳光下暴晒直至干燥,制得1：1、1：10古法千金黄连丸,分别取其2 g使用适量甲醇：水(20：80)超声溶解,充分摇匀,过滤,即得梓醇条件样品溶液;同上使用甲醇：盐酸(100：1)溶解,即得生物碱条件样品溶液。

2.3.6今法千金黄连丸供试品溶液的制备 取干燥至恒重的黄连饮片5 g,再分别取生地黄5、50 g,加入10倍量纯净水,煎煮1 h后用4层100目纱布趁热过滤残渣,收集煎液,残渣同法再继续煎煮2次,弃去残渣,合并3次煎液,制得1：1、1：10今法千金黄连丸,煎液于60 ℃减压浓缩成浸膏,使用适量甲醇：水(20：80)超声溶解,充分摇匀,过滤,即得梓醇条件样品溶液;同上使用甲醇：盐酸(100：1)溶解,即得生物碱条件样品溶液。

2.4方法学考察

2.4.1专属性考察 移取“2.2节”下对照品溶液、“2.3节”下供试品溶液适量,按“2.1节”下色谱条件,分别进样分析,采用origin 2018版软件作图。结果表明各供试品溶液中生物碱和梓醇的保留时间与对照品溶液中梓醇和生物碱的保留时间基本一致,说明此方法专属性强。结果见图1、图2。

A.生物碱混标对照品;B.黄连供试品;C.黄连水煎供试品;D.地黄水煎供试品;E.鲜地黄供试品;F.古法1：1千金黄连丸供试品;G.古法1：10千金黄连丸供试品;H.今法1：1千金黄连丸供试品;I.今法1：10千金黄连丸供试品。1.表小檗碱;2.黄连碱;3.巴马汀;4.小檗碱。

J.梓醇对照品;K.黄连供试品;L.黄连水煎供试品;M.地黄水煎供试品;N.鲜地黄供试品;O.古法1：1千金黄连丸供试品;P.古法1：10千金黄连丸供试品;Q.今法1：1千金黄连丸供试品;R.今法1：10千金黄连丸供试品。1.梓醇。

2.4.2线性关系考察 移取“2.2节”下对照品储备液适量,分别用甲醇：水(20：80)、甲醇：盐酸(100：1)依次以2倍梯度稀释5次,即得6份浓度不同的溶液,按“2.1节”下分别进样分析,记录峰面积。以浓度(X,μg·mL-1)为横坐标,峰面积(Y)为纵坐标进行线性回归,其回归方程、线性范围和相关系数(R2)等结果见表1。

表1 5种成分的回归方程及线性范围

2.4.3精密度考察 移取“2.3.5节”和“2.3.6节”下供试品溶液适量,按“2.1节”下色谱条件分别进样分析,均连续进样测定6次,记录生物碱和梓醇的峰面积,并计算RSD值。测得古法1：1千金黄连丸中表小檗碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱、梓醇峰面积的RSD值分别为1.30%、1.34%、1.42%、0.48%、1.23%;古法1：10千金黄连丸RSD分别为1.53%、1.51%,1.62%、1.50%、0.46%;今法1：1千金黄连丸RSD分别为0.36%、0.21%、0.14%、0.17%、0.72%;今法1：10的RSD分别为1.92%、1.41%、1.39%、1.36%、0.90%,表明仪器精密度良好。

2.4.4稳定性考察 移取“2.3.5节”和“2.3.6节”下所制供试品溶液适量,分别于室温下放置0、2、4、6、8、10、12和24 h,按“3.1节”下色谱条件分别进样分析,记录生物碱和梓醇的峰面积,并计算RSD值。测得古法1：1千金黄连丸中表小檗碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱、梓醇峰面积的RSD值分别为1.27%、0.71%、0.76%、0.91%、0.83%;古法1：10千金黄连丸的RSD分别为1.65%、1.85%、1.67%、1.50%、0.56%;今法1：1千金黄连丸的RSD分别为1.19%、1.38%、1.26%、1.19%、1.48%;今法1：10千金黄连丸的RSD分别为1.45%、1.52%、1.14%、1.22%、0.47%,说明4种供试品溶液在24 h内的稳定性良好。

2.4.5重复性考察 按“2.3.5节”和“2.3.6节”下供试品溶液的制备方法,各平行制备6份,按“2.1节”下色谱条件分别进样分析,记录生物碱和梓醇的峰面积,计算各含量,并计算含量RSD值。测得古法1：1千金黄连丸中表小檗碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱、梓醇含量的RSD值分别为1.87%、2.42%、2.87%、2.00%、1.90%;古法1：10千金黄连丸的RSD分别为1.86%、2.13%、1.76%、1.59%、1.82%;今法1：1千金黄连丸的RSD分别为2.64%、2.02%、2.85%、2.60%、1.60%;今法1：10千金黄连丸的RSD分别为2.06%、3.63%、2.82%、2.60%、1.66%,说明该方法的重复性良好。

2.4.6加样回收率实验 取6份已知梓醇含量的样品,精密加入等量的梓醇对照品溶液,按“2.3.5节”和“2.3.6节”下制备供试品溶液,按“2.1.1节”下色谱条件进样分析,测定梓醇的含量,计算回收率;取6份已知生物碱含量的样品,精密加入等量的生物碱对照品溶液,按“2.3.5节”和“2.3.6节”下制备供试品溶液,按“2.1.2节”下色谱条件进样分析,测定各生物碱的含量,计算回收率。结果见表2,结果表明方法的准确度良好。

表2 生物碱和梓醇加样回收率实验结果

2.5千金黄连丸中生物碱和梓醇的含量测定 按“2.3节”方法制备供试品6批,按“2.1节”下色谱条件分别进样分析,记录峰面积,采用外标法,计算确定各供试品中生物碱和梓醇的含量,结果见表3。由表3可知当黄连与鲜地黄配伍,生物碱与梓醇含量均少于单药,黄连与地黄配伍,生物碱含量少于单药,但增加了梓醇含量。4种千金黄连丸相互比较,古法1：1中4种生物碱含量都最高,梓醇含量最低;古法1：10中4种生物碱含量最低;今法1：1各含量均高于古法1：10,今法1：10中仅小檗碱含量略低于今法1：1,其余均高于今法1：1。

表3 不同供试品中5种成分含量测定结果

2.6千金黄连丸的主成分分析(principal component analysis,PCA)分析 以上述24批千金黄连丸5个成分的含量为变量,运用SIMCA-P 14.0版软件进行主成分分析,结果见图3。24批千金黄连丸直观的分为4类,且符合所做的4种千金黄连丸,表明4种千金黄连丸的化学成分含量有很大差异。

图3 千金黄连丸主成分分析

3 讨论

本实验采用HPLC法分析了黄连、鲜地黄汁、黄连水煎,生地黄水煎以及古今千金黄连丸中的化学成分。由图1可知,黄连、黄连水煎及古今千金黄连丸中均检测到了表小檗碱、黄连碱、巴马汀和小檗碱,地黄汁和地黄水煎未检测出。由图2可知,鲜地黄汁、地黄水煎及古今千金黄连丸中均检测到了梓醇,黄连、黄连水煎未检测出。说明黄连与鲜地黄汁、生地黄配伍后,主要药效成分仍稳定存在。

当黄连与地黄,鲜地黄配伍后,主要有效降糖成分生物碱和梓醇含量减少,但制备过程中是否有新物质生成需要进一步研究。贺梦云[5]报道黄连丸治疗糖尿病优于单药黄连,并且提高了小檗碱和黄连碱在糖尿病大鼠体内的吸收。雷蕾[4]报道黄连、生地黄及其主要成分小檗碱、梓醇对血糖、血脂、葡萄糖耐量、血清胰岛素、胰岛素抵抗指数、胰岛素敏感指数等指标均有一定疗效,但是效果不如千金黄连丸。这体现了中药复方通过多成分、多途径、多靶点的协同作用发挥了单味药无法获得的治疗效果[16-17],同时也揭示了中药复方无法单纯以含量来判定其药效差异,后续将结合动物实验探究其药效差异。

本实验建立了HPLC法测定不同配比古今千金黄连丸中表小檗碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱和梓醇的含量,经验证该法5个成分分离度良好,线性考察、重复性考察、精密度考察、加样回收率考察均符合要求,含量测定结果表明2种制备方法在有效降糖成分含量中各有优势,PCA分析表明4种千金黄连丸化学成分含量有很大差异,可以初步判定其降糖效果存在差异。