基于气相色谱-质谱联用结合多元统计分析不同炮制方法对砂仁挥发性成分的影响*

李佳鑫,周玲娟,张丽霞,苏晶,任佳慧,周天浩,王金辉,李光

(1.黑龙江中医药大学药学院,哈尔滨 150000;2.中国医学科学院药用植物研究所云南分所,云南景洪 666100;3.西双版纳傣族自治州人民医院重症监护科,云南景洪 666100;4.云南省南药资源可持续利用研究重点实验室,云南景洪 666100;5.滇西应用技术大学傣医药学院,云南景洪 666100)

砂仁为姜科植物阳春砂(AmomumvillosumLour.)、绿壳砂(AmomumvillosumLour.var.xanthioidesT.L.Wu et Senjen)或海南砂(AmomumlongiligulareT.L.Wu)的干燥成熟果实[1]。砂仁性温,味辛,归脾、胃经,具有镇痛消炎、刺激发汗、抗溃疡、抗菌、降血糖、保护胃肠等药理作用,在临床上具有化湿开胃、温脾止泻、理气安胎的功效,为我国著名的“四大南药”之一[2-4]。砂仁活性成分主要为挥发油类,包括乙酸龙脑酯、樟脑、柠檬烯、龙脑等,其中乙酸龙脑酯是砂仁挥发油中主要抗炎活性成分[5]。砂仁始载于《药性论》,炮制始见于金代张元素[6]的《医学启源》,书中有“捣细用”的记载,清代丰富了炮制辅料,包括姜汁、盐等,如《嵩崖尊生全书》首次采用了用姜汁制的方法,“姜汁拌”[7]。目前临床上砂仁多采用炒制、姜炙、盐炙方法进行炮制,但不同炮制方法对砂仁药材成分的影响还未见报道。本文基于气相色谱-质谱联用(gas chromatography-mass spectromentry,GC-MS)法结合多元统计分析探讨砂仁经炒制、姜炙及盐炙后对砂仁挥发性成分的影响,以期丰富砂仁炮制理论,为深入研究砂仁不同炮制品药理活性提供借鉴。

1 仪器与样品

1.1仪器 MS-DL01电磁炉(中山市美苏电器有限公司);DV215CD 分析天平(美国奥豪斯,感量:0.1 mg);FW80高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司);SB-800D超声波清洗机(宁波新艺超声波设备有限公司);7890A GC气相色谱(美国安捷伦公司);5975C质谱仪(美国安捷伦公司);Sigmal-14台式低速离心机(中科星宇科技发展有限公司)。

1.2药品与试剂 阳春砂样品采自西双版纳州基诺乡,经中国医学科学院药用植物研究所云南分所张丽霞研究员鉴定为AmomumvillosumLour.;正己烷(分析纯,含量:98.0%,批号:20200817,天津市风船化学试剂科技有限公司)。

2 方法与结果

2.1样品处理

2.1.1砂仁原药材处理方法 取砂仁原药材剥去外壳,种子团与外壳分别粉碎,用50 mL锥形瓶精密称取1.0 g,加入溶剂正己烷20 mL,放入超声仪器中超声30 min(r=64 mm),然后放入离心机中5 000 r·min-1离心3 min,(r=64 mm),最后用孔径0.22 μm微孔滤膜过滤,放入样品瓶中备用。

2.1.2炮制砂仁处理方法 参照《中华人民共和国药典》(2020年版)方法,称取生姜15 g,挤压榨汁后加纯化水至60 mL得到姜汁,同时配制5%氯化钠溶液。称取阳春砂150 g,分别加入姜汁、5%氯化钠溶液、蒸馏水60 mL,搅拌后保证样品均浸润,1 h后电磁炉200 W翻炒20 min直至砂仁表面吸干水分,分别得到姜炙、盐炙、炒制砂仁样品。放凉后剥去外壳,种子团与外壳分别粉碎,参照“2.1.1节”方法处理后备用。

2.2GC参数 Agilent 19091S-433色谱柱(30 m×250 μm,0.25 μm);升温程序为初始温度100 ℃,以5 ℃·min-1升温至200 ℃,再以40 ℃·min-1升温至280 ℃,并保持3 min,后运行温度为280 ℃,运行时间为10 min;进样口温度250 ℃;载气为高纯氦气,流速为1.0 mL·min-1;分流进样,分流比10：1,进样量为1 μL。

2.3质谱参数 传输线温度250 ℃;离子源温度230 ℃;四级杆温度150 ℃;电离方式:EI源;电离电压70 eV;扫描范围m/z30.00～550.00,阈值为50,全扫描模式,溶剂延迟时间为2.00 min。

2.4数据处理方法 将GC-MS获得的以“D”结尾的原始质谱数据用ProteoWizard转换成“.mzXML”格式,通过MSDIAL软件进行预处理,包括数据基线过滤、峰识别、峰对齐、保留时间校正、提取峰面积、标准化。将得到的包含质荷比m/z、保留时间和峰面积等的数据矩阵结果导入SIMCAP13.0(Umetrics,瑞典)软件和MetaboAnalyst 5.0平台进行多元统计分析,首先采用有监督的正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)和层次聚类分析区分组间代谢物的总体差异,而后以变量投影重要性VIP>1.5及t检验的P<0.05筛选潜在的生物标志物,使用NIST 11数据库进行差异性化合物鉴定。

2.5不同方法炮制对砂仁果皮及种子团挥发性成分的影响

2.5.1不同方法炮制砂仁果皮及种子团的总离子流图 采用GC-MS法对不同方法炮制的砂仁果皮及种子团进行检测,所得到的总离子流图(TIC)见图1。由图可知,砂仁种子团及果皮之间成分差异显著,不同方法炮制样品之间成分也存在明显差异。

Con-P.砂仁原药材果皮;SP-P.炒制品果皮;JP-P.姜炙品果皮;YP-P.盐炙品果皮;Con-Z.砂仁原药材种子团;SP-Z.炒制品种子团;JP-Z.姜炙品种子团;YP-Z.盐炙品种子团。

2.5.2不同方法炮制砂仁药材的成分差异比较 采用MSDIAL软件得到不同炮制方法砂仁果皮和种子团预处理数据,使用MetaboAnalyst 5.0平台进行有监督的正交偏最小二乘法判别分析,得到OPLS-DA 得分图,见图2。

A-C.果皮;D-F.种子团;Con.原药材;SP.炒制品;JP.姜炙品;YP.盐炙品。

A-C.果皮,其中A为原药材与炒制品比较;B.原药材与姜炙品比较;C.原药材与盐炙品比较;D-F.种子团;其中D原药材与炒制品比较;E.原药材与姜炙品比较;F.原药材与盐炙品比较。

A-C.果皮,其中A为原药材与炒制品比较;B.原药材与姜炙品比较;C.原药材与盐炙品比较;D-F.种子团,其中D为原药材与炒制品比较;E.原药材与姜炙品比较;F.原药材与盐炙品比较。

A-C.果皮,其中A为原药材与炒制品比较;B.原药材与姜炙品比较;C.原药材与盐炙品比较;D-F.种子团,其中D为原药材与炒制品间比较;E.原药材与姜炙品比较;F.原药材与盐炙品比较。

由图2可以看出,经炮制后姜炙砂仁(JP)、炒制砂仁(SP)、盐炙砂仁(YP)与砂仁原药材(Con)的成分具有明显差异,经OPLS-DA处理后,两两之间能够明显分开。

为验证OPLS-DA模型是否存在过度拟合情况,使用SIMCA-P软件进行数据置换检验,得到的结果如图3所示。由图可知,各组R2值和Q2值均<1,Q2在Y轴的截距为负值,且R2和Q2实验值比原始值低,证明模型没有过度拟合。

2.6不同炮制方法砂仁药材挥发性成分差异鉴别 为了鉴别不同炮制方法砂仁药材的挥发性成分差异,以OPLS-DA模型第一主成分的VIP>1.5,P<0.05为标准。通过相关文献比对,并结合NIST11数据进行快速的定性鉴别分析,从中筛选共鉴定出49个可能的差异成分,见图4—5和表1。

表1 砂仁不同炮制品与砂仁原药材的成分差异比较

3 讨论

砂仁作为传统温中健脾药,历代医家对砂仁的炮制方法也在不断发展,最初砂仁除生用外,多为炒制,如《雷公炮制药性解》中记载砂仁“炒,去衣研用”,随后炮制辅料也不断增加,多用盐炙、姜汁炙、萝卜汁炙等方法。而砂仁壳较砂仁种子团力缓,如《药笼小品》记载砂仁壳“辛香利气,凡腹胀、泻痢等症,俱可用之,无砂仁燥窜之弊”。不同炮制方法对砂仁种子团和壳中成分的影响还未见报道。基于此,本文利用气相质谱联用技术开展了比较研究,以期探讨砂仁不同炮制品与原药材的差异成分。

在砂仁炒制过程中加入与盐炙、姜炙相同体积的水,目的是为了排除水对姜炙、盐炙砂仁结果的影响。本实验通过考察不同炮制方法对砂仁药材果皮及种子团中成分的影响,结果发现49种差异成分中只在种子团中发生变化的成分有14种,只在果皮中发生变化的成分有22种,其他差异成分在不同炮制品中的种子团和果皮中均有显著差异。与砂仁原药材比较,炒制品有18种成分发生了显著变化,种子团中成分改变的有9种,果皮中改变的成分有8种,种子团和果皮均改变的成分有1种,大多数成分趋势为降低,而α-松油醇、乙酸龙脑酯、9-甲基-4-癸酮在炒制品果皮中升高,松油醇、甲酸龙脑酯在炒制品种子团中升高,(-)-α-侧柏烯在种子团及果皮中均降低;姜炙品中有20种成分发生了变化,种子团中成分改变的有3种,果皮中改变的成分有16种,种子团和果皮均改变的成分1种,大多数差异性成分趋势均为升高,而(-)-α-侧柏烯、月桂烯、β-榄香烯、(E)-β-金合欢烯、(5Z,10Z)-5,10-十五烷醛在果皮中降低,香芹蒎酮、2-茨醇在种子团中降低,γ-松油烯在种子团及果皮中均升高;盐炙品中有31种成分发生了变化,种子团中成分改变的有16种,果皮中改变的成分有13种,种子团和果皮均改变的成分2种,3,5-二甲基-4-辛烷、2,4- 二甲基癸烷、2-单棕榈酸甘油在果皮中降低,在种子团中升高。尽管生姜中含有与砂仁相同的挥发性成分如莰烯、月桂烯、樟脑、水芹烯、松油醇、榄香烯、金合欢烯等,但砂仁经姜炙后与砂仁原药材比较其中莰烯、水芹烯、松油醇等没有显著差异,樟脑、γ-榄香烯在姜炙品果皮中含量增加,而金合欢烯、月桂烯等成分在姜炙品果皮中含量减少[8]。可见砂仁经姜炙后两者共有的挥发性成分变化趋势不尽相同,尽管机制并不清楚,但体现了中药炮制的复杂性。

《中药炮制》中记载砂仁的炮制方法为“晒去灰尘,拣去杂质,同时打碎,若取其温中止呕则用姜汁炒,若取其补肾,用盐水炒”。砂仁盐炙后主归肾经,辛温之性略减,温而不燥,并能引药下行,增强理气安胎、温肾缩尿的作用,可用于妊娠恶阻,胎动不安[9]。砂仁不同炮制品在临床中得到广泛应用,砂仁经炒制后能够提高其在妊娠呕吐、理气安胎方面的功效,炒姜后具有温经止血的功效,姜炙砂仁用于治疗脾胃寒、腹痛腹泻、出血[10]。

有研究表明意外摄入樟脑可造成严重的肝脏和中枢神经系统损伤,常规使用也经常会导致轻度肝神经毒性,可能症状不明显但还是具有一定的风险[11],经炒制、姜炙、盐炙后,砂仁炮制品种子团中樟脑含量显著降低,可见经炮制后可能会提高砂仁的安全性。现代研究发现乙酸龙脑酯具有保胎、杀虫、止泻、抗炎、抗肿瘤、平滑肌运动、心血管活性、止痛、改善记忆等药理作用[12],而炒制后砂仁果皮中乙酸龙脑酯含量显著升高,但盐炙及姜炙后并未发生显著变化。除此以外,笔者还发现对人体具有潜在毒性的D-柠檬烯、蒎烯等成分经炒制后,种子团中含量也明显下降。但由于上述差异成分的活性研究较少,成分的差异是否是造成不同炮制品功能的差异还有待深入研究,尽管相关机制还不清楚,但也侧面反映了砂仁炮制的科学性。

本实验发现砂仁经盐炙后,较其他炮制方法比较烷烃类成分更容易发生显著变化,其机制有待于进一步研究。此外,本文仅开展了不同炮制方法对砂仁成分的影响研究,如何结合砂仁炮制品的临床功效,通过药理实验阐明不同炮制方法的科学性将是本课题组下一步开展的工作。