地黄单体梓醇促成骨细胞分化的活性研究*

李路易，梁冬雨，易清清，沙爽，史俊峰，梁鹏晨，常庆，4

(1.上海中医药大学研究生院，上海 201203；2.上海健康医学院附属嘉定区中心医院全科医学教育与研究中心，上海 201800；3.上海健康医学院分子影像学重点实验室，上海 201318；4.上海中医药大学，上海 201203)

骨质疏松症是一种以骨脆性增加、骨量减少为特征并与年龄相关的全身性骨骼疾病，为最多发骨病[1]。其病理原因主要是由于“骨形成-骨吸收”平衡紊乱，骨吸收量大于骨形成量[2]。因此，目前用于骨质疏松症的临床治疗分为两类：抑制破骨细胞功能的抗吸收剂和诱导成骨细胞骨形成的合成代谢剂[3]。

目前，骨质疏松症的药理学研究大都集中在抗骨吸收上，但抗骨吸收治疗可以防止骨骼结构的丧失却不能恢复骨量及结构[4]。并且双膦酸盐等抗吸收药物在长期使用后会产生骨坏死和肿瘤发生风险增加等副作用[5-6]。此外，FDA批准的合成代谢剂甲状旁腺激素价格昂贵，临床使用时管理困难，因其量过多时将导致完全相反的作用[7-8]。因此，迫切需要找到一种新的有效的合成代谢剂来治疗骨质疏松症。

地黄(Rehmannia glutinosa)为玄参科多年生草本植物地黄块根，其主要化学成分为环烯醚萜类和糖类。其中环烯醚萜类化合物以梓醇含量最高，是《中华人民共和国药典》2015年版中地黄的定性指标[9]。现代药理学研究发现，地黄具有降血糖、抗肿瘤和抗抑郁等功效，对梓醇的研究发现它可以重现地黄的药理作用[10]。近年来，关于地黄治疗骨质疏松的报道日益增多，且以地黄为主的复方具有明显的抗骨质疏松活性[11]，为了进一步探讨地黄的抗骨质疏松机制，本实验使用提取的地黄主要活性成分梓醇，采用细胞培养技术，检测分析不同浓度的梓醇对小鼠成骨细胞株增殖、分化和矿化的影响。

1 材料与仪器

1.1药物 梓醇购买于成都睿斯思生物科技有限公司(批号：Z-005-180315)，纯度大于99%。称取梓醇200 mg，溶解于50 mL α-MEM(α-minimum Eagle’s medium)完全培养基中，0.22 μm过滤分装，配制成为4000 mg·L-1的母液，4 ℃保存备用，在后续实验中根据需要加入相应体积或稀释体积。

1.2试剂 低糖α-MEM培养基(Gibco，批号：SH30265.01)，胎牛血清(Gibco，批号：16140-071)，胰酶(Amresco，批号：1928609)，二甲基亚砜(Sigma，批号：D2650)，CCK8(东仁化学科技有限公司，批号：CK04)，茜素红(Sigma，批号：A5533)，碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：059-2-2)，PrimeScripTMRT reagent Kit(Takara，批号：RR037A)，TB GreenTMPremix Ex TaqTMII(Takara，批号：RR820A)。

1.3仪器 CO2培养箱(Thermo Forma，311)，超净工作台(苏州净化设备有限公司，SJCJ-1FD)，普通光学显微镜(Leica，ICC50W)，倒置相差显微镜(Leica，DMi8)，Model 680型酶标仪(Bio-Rad，1510)，可调式移液器(Eppendorf，4921)，培养板(Costar，024)，高通量实时荧光定量PCR(qRT-PCR)仪(Roche，Z480)。

2 方法

2.4梓醇对MC3T3-E1成骨关键基因表达的影响 检测梓醇对Runx2(runtrelatedtranscriptionfactor2)，Bglap(bonegammacarboxyglutamateprotein)，Col1a1(collagentypeIalpha1chain)的mRNA表达的影响，取生长状态良好的细胞，以1×106cells·mL-1密度接种到6孔板中，待细胞周期同步化后，加入配好的(200，500 mg·L-1)梓醇培养3 d，空白对照组仅加入α-MEM完全培养液作为对照(记为0 mg·L-1)。当细胞汇合至90%以上时，用Trizol裂解细胞，提取总RNA并及时按照说明书逆转录为cDNA。以cDNA为模板配制20 μL的反应体系，引物序列见表1。使用Roche LightCycler480实时荧光定量PCR仪按说明书进行测定。最后使用最大二阶倒数法计算实验组各基因的相对表达水平。

3 结果

3.1梓醇不促进MC3T3-E1的增殖 通过CCK8检测分析不同浓度梓醇对MC3T3-E1增殖的影响，不同浓度(1，10，100，500，800，1 000，2 000，4 000 mg·L-1)梓醇溶液在1，3，6 d培养后对细胞的增殖没有产生影响，同时在4 000 mg·L-1高浓度的药物使用量时仍未抑制其增殖，提示梓醇对MC3T3-E1增殖未产生影响，并无细胞毒性。见图1。

3.2梓醇促进MC3T3-E1 ALP的分泌 为观察梓醇促进对成骨细胞分化的影响，采用氨基安替吡啉测酚法检测分析不同浓度梓醇对MC3T3-E1细胞ALP分泌的影响。检测结果显示，细胞培养4 d时，梓醇在低浓度时(<500 mg·mL-1)对MC3T3-E1 ALP的分泌无显著促进作用，当梓醇浓度>500 mg·L-1的时候显著促进了MC3T3-E1 ALP的分泌。继续培养8 d后，低浓度梓醇对ALP的分泌仍无显著作用，而高浓度梓醇促进了ALP分泌，组间差异无统计学意义。见图2。

3.3梓醇促进了MC3T3-E1矿化 根据图2的分析结果，进一步通过ARS检测500 mg·L-1梓醇对MC3T3-E1矿化的影响。梓醇促进MC3T3-E1矿化如图3和4所示。图3显示在未加成骨诱导液只加500 mg·L-1梓醇情况下诱导21 d后，梓醇促进了钙盐的沉积，并形成的钙结节。图4显示在加了成骨诱导液的情况下，添加500 mg·L-1梓醇可以进一步促进钙盐的沉积和钙结节的形成，说明梓醇促进了MC3T3-E1细胞的矿化。白色尖头指示为钙结节，标尺长度为10 μm。

3.4梓醇促进成骨分化关键性基因的表达 据以上结果，进一步通过qRT-PCR检测500 mg·L-1梓醇促进了成骨分化关键性基因表达的影响，结果如图5所示，梓醇在500 mg·L-1浓度时显著性促进了3种基因的表达(①P<0.05，②P<0.001)，这3种基因为成骨分化矿化的关键性基因[11]。

4 讨论

地黄的抗骨质疏松作用已在体内和体外实验中得到了部分证实[11]。梓醇是地黄的主要成分，其对改善骨质疏松的作用及安全和有效浓度仍有待研究。本研究使用小鼠成骨细胞前体细胞MC3T3-E1在体外模拟梓醇作用下的成骨分化过程，通过检测不同浓度梓醇对成骨细胞增殖和成骨分化的影响，分析梓醇促成骨分化的安全和有效剂量。CCK8检测结果提示，即使在很高的浓度下，梓醇对细胞没有出现抑制作用，表现出很好的安全性。不同浓度的梓醇在不同时间点对成骨细胞的增殖均无明显促进作用，这与经典的促成骨诱导因子BMP2(bone morphogenetic protein 2)有很大的差异。BMP2在成骨过程中对细胞的增殖和分化均有很强的诱导作用[12]。考虑到老年骨质疏松的发病机制以骨量的丢失为主，BMP2强烈的促成骨作用可能导致骨硬化，造成新的骨折风险。梓醇温和的诱导成骨分化和矿化作用并不依赖细胞数量的变化，对改善老年骨质疏松症具有较好的安全性。

表1 qRT-PCR引物序列

图1 梓醇对MC3T3-E1增殖的影响

Fig.1EffectofcatalpolonMC3T3-E1proliferation

①与空白对照组比较，P<0.01。

图2 梓醇对MC3T3-E1 ALP分泌的影响

①Compared with blank control group，P<0.01.

Fig.2EffectofcatalpolonALPsecretioninMC3T3-E1

成骨细胞在骨形成过程中一般要经历早、中、晚三个阶段，而ALP可以作为成骨细胞分化早期和中期的指示物[13]。本研究检测分析了不同浓度梓醇作用于成骨细胞后ALP活性的变化。ALP活性测定实验结果显示，梓醇在500 mg·mL-1浓度时，小鼠成骨细胞ALP活性有明显的升高，提示成骨细胞的早期分化能力增强。茜素红染色是茜素红与钙盐沉积发生显色反应，产生一种深红色的带色化合物，成骨细胞进一步矿化沉积的钙结节同时被染成深红色，钙化结节的形成是成骨细胞分化成熟和矿化的标志[14]。通过ARS可以了解成骨细胞晚期分化的情况。染色结果显示500 mg·L-1梓醇促进了细胞外基质中钙结节的形成，促进骨基质的矿化。成骨诱导液能够促进成骨细胞合成胶原并钙化。梓醇与成骨诱导液联合使用，显著增加了钙结节的形成，提示梓醇可以协同成骨诱导液促进骨基质矿化。ALP和ARS检测水平的升高提示，梓醇在体外有明显的促进成骨细胞分化和矿化作用。

图3 梓醇对MC3T3-E1矿化的影响(×50)

Fig.3EffectofcatalpolonMC3T3-E1mineralization(×50)

图4 梓醇在成骨诱导液中对MC3T3-E1矿化的影响(×50)

Fig.4EffectofcatalpolonMC3T3-E1mineralizationinosteogenicinductionfluid(×50)

在成骨分化过程中，成骨细胞会分泌一些分化关键蛋白。Runx2是成骨细胞分化过程中的总开关，调节成骨分化中多个基因的表达；Col1α1为组成骨基质的主要成分；Bglap是成骨分化晚期的标志物，在骨基质矿化成熟中起重要作用[15]。这些蛋白对应的基因是成骨分化、矿化的重要标志性基因。我们在mRNA水平检测了给予梓醇后MC3T3-E1细胞成骨分化关键基因的表达水平的变化。qRT-PCR结果提示，梓醇能显著上调Runx2，Col1α1和Ocn的mRNA表达水平，在mRNA水平进一步验证梓醇具有促进成骨细胞分化作用。

本研究通过体外模拟实验确定了梓醇具有促进成骨细胞分化和矿化的作用；即使给予较高浓度，并未出现细胞毒性作用，表现出较好的安全性。结合已有梓醇体内血药浓度检测的报道[16]，为设计梓醇促进成骨分化的体内实验提供了依据。

①与空白对照组比较，P<0.01；②与空白对照组比较，P<0.05。