CXCR4 MFAP2 KLF4在分化型甲状腺癌中的表达及对预后的预测价值研究

顾占国, 李 军, 梁金屏, 石福民

(河北省唐山市人民医院头颈外科, 河北 唐山 063000)

甲状腺癌为内分泌恶性肿瘤中常见的一种,约占全身恶性肿瘤的1.0%～5.0%,甲状腺癌可按组织学分类为未分化型以及分化型,其中大约90%为分化型甲状腺癌(differentiated thyroid cancer,DTC),大部分DTC患者经规范化治疗后能获得良好预后,5年生存率可达90%,但仍有部分病例预后不良,故早期评估DTC预后有一定临床指导意义[1]。近些年生物学分子标志物在DTC发生、疾病进展及预后评估中受到广泛关注,趋化因子4受体(Chemokine 4 receptor,CXCR4)在细胞分化、增殖、侵袭、浸润及肿瘤生长等过程中发挥重要作用,CXCR4异常表达与分化型甲状腺癌的发生和进展有关[2]。微纤维相关蛋白2(microfibril associated protein 2,MFAP2)是一种在组织稳态、微纤维组装中发挥关键作用的细胞外基质糖蛋白,其水平异常升高可促使细胞增殖、侵袭及迁移,并阻止细胞凋亡,是胰腺癌潜在的生物标志物[3]。Krüppel样因子4(Krüppel like factor 4,KLF4)是一种锌指转录因子,在不同肿瘤中充当抑癌或促癌基因,已有研究表明KLF4在肝癌、宫颈癌、肾癌、卵巢癌等肿瘤中呈低表达,KLF4低表达能促进肿瘤增殖[4]。目前国内关于CXCR4、MFAP2、KLF4与DTC的系统报道较少,本研究拟研究CXCR4、MFAP2、KLF4在DTC中的表达及对预后的预测价值,希望为临床诊治DTC提供指导,报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料:本研究取得本院伦理委员会批准。选择我院2019年7月至2020年7月收治的113例DTC患者,术中留取其癌组织及癌旁正常组织(距肿瘤切缘≥2cm),其中男28例、女85例;年龄为19～72岁,平均(54.29±6.11)岁;病理类型:乳头状癌82例、滤泡状癌31例;瘤灶直径:<2cm 51例,≥2cm 62例;TNM分期:Ⅰ+Ⅱ期40例、Ⅲ期73例;淋巴结转移75例;肿瘤分化程度:中高分化44例、低分化69例。纳入标准:①原发性肿瘤且为初次手术,经术后病理证实;②意识清楚且认知功能正常;③病历资料完整;④签署知情同意。排除标准:①有其他部位恶性肿瘤;②有感染性或传染性疾病;③良恶性结节并存;④入组前接受手术或放化疗等;⑤合并终末期肾病、终末期肝病等影响生存期的疾病;⑥已出现远端转移;⑦有颈部手术史或严重凝血功能障碍;⑧妊娠、哺乳期女性;⑨生存时间预计小于3个月。

1.2方 法

1.2.1收集资料:包括癌灶直径(<2cm/≥2cm)、年龄(<50岁/≥50岁)、性别(男/女)、病理类型(乳头状癌/滤泡状癌)、淋巴结转移(无/有)、肿瘤分化程度 (中高分化/低分化)、TNM分期(Ⅰ+Ⅱ期/Ⅲ期)等。

1.2.2采用蛋白免疫印迹法检测DTC组织及癌旁正常组织中CXCR4、MFAP2、KLF4表达水平:术中留取癌组织及癌旁正常组织液氮下保存,放于-80℃冰箱中保存待测。取组织标本,RIPA裂解,提取总蛋白,BCA法测蛋白浓度,100℃下变性,SDS-PAGE电泳分离总蛋白,转膜,脱脂牛奶封闭2h,TBST洗涤(5min/次,3次),将其放入对应的一抗(CXCR4、MFAP2、KLF4、GAPDH)以及一抗稀释液(1∶500)混悬液中,4℃条件下孵育过夜,TBST洗涤(5min/次,3次),放入二抗以及二抗稀释液(1∶2000)混悬液中,25℃条件下孵育120min,TBST洗涤(5min/次,3次),将超敏ECL发光液滴于膜上,行显影、定影处理,以GAPDH为内参,Image J软件分析各目标条带灰度值。

1.2.3随访情况:DTC患者出院后,采用电话或者门诊复查的方式随访3年,每半年随访1次,随访截止到2023年7月或死亡,统计DTC患者3年总生存情况。

2 结 果

2.1DTC组织及癌旁正常组织中CXCR4、MFAP2、KLF4表达情况:与癌旁正常组织比较,DTC组织CXCR4、MFAP2蛋白表达量显著升高(P<0.05),KLF4蛋白表达量显著降低(P<0.05)。见表1。

表1 DTC组织及癌旁正常组织中CXCR4 MFAP2 KLF4表达情况

2.2癌组织中CXCR4、MFAP2、KLF4表达水平与DTC临床病理特征的关系:性别、年龄、病理类型、癌灶直径不同者CXCR4、MFAP2、KLF4蛋白表达量差异无统计学意义(P>0.05),TNM分期Ⅲ期、发生淋巴结转移、肿瘤低分化者CXCR4、MFAP2蛋白表达量显著高于TNM分期Ⅰ+Ⅱ期、未发生淋巴结转移、肿瘤中高分化者(P<0.05),TNM分期Ⅲ期、发生淋巴结转移、肿瘤低分化者KLF4蛋白表达量显著低于TNM分期Ⅰ+Ⅱ期、未发生淋巴结转移、肿瘤中高分化者(P<0.05)。见表2。

表2 癌组织中CXCR4 MFAP2 KLF4表达水平与DTC临床病理特征的关系

2.3CXCR4、MFAP2、KLF4对DTC预后的预测价值:113例DTC患者随访3年期间失访8例,最终获得随访者105例。死亡组患者CXCR4、MFAP2蛋白表达量显著高于存活组(P<0.05),KLF4蛋白表达量显著低于存活组(P<0.05)(表3)。绘制ROC曲线发现,CXCR4、MFAP2、KLF4单独或联合预测DTC预后的AUC(95%CI)分别为0.692(0.562～0.823)、0.729(0.590～0.869)、0.766(0.622～0.910)、0.832(0.690～0.975),联合预测的效能显著优于单项检测(P<0.05)(表4、图1)。

图1 血清t-PA、CgA、LP-PLA2单独或联合预测PCI术后发生MACE的ROC曲线

表3 死亡组与存活组CXCR4 MFAP2 KLF4表达情况

表4 CXCR4 MFAP2 KLF4对DTC预后的预测价值

2.4Cox回归模型单因素和多因素分析影响DTC预后的相关因素:Cox回归分析显示,淋巴结转移、TNM分期Ⅲ期、肿瘤低分化、CXCR4表达升高、MFAP2表达升高、KLF4表达降低是DTC预后的危险因素(P<0.05)。见表5。

3 讨 论

趋化因子是一类能够激活并趋化白细胞的促炎性细胞因子,可参与恶性肿瘤疾病的发生发展,趋化因子的受体分别为CC受体、CXC受体、XC受体、CX3C受体。CXCR4属于CXC受体,它的特异性配体为趋化因子基质细胞衍生因子1(stromal cell-derived factor,SDF-1)。CXCR4/SDF-1轴可以聚合癌细胞肌动蛋白丝,形成假伪足诱导癌细胞侵袭与转移,同时还可促使肿瘤血管形成,影响肿瘤生长[5]。本研究结果显示,DTC组织CXCR4蛋白表达量显著高于癌旁正常组织,表明CXCR4在DTC中呈高表达,与Wilhelm A等[6]报道中CXCR4的变化趋势基本相同。同时,TNM分期Ⅲ期、发生淋巴结转移、肿瘤低分化者CXCR4蛋白表达量显著高于TNM分期Ⅰ+Ⅱ期、未发生淋巴结转移、肿瘤中高分化者,提示CXCR4可能参与了DTC进展过程。对其预后研究发现,死亡组患者CXCR4蛋白表达量显著高于存活组,且CXCR4表达升高是DTC预后的危险因素,说明CXCR4在DTC预后评估方面有一定潜力。分析原因可能为CXCR4可能与其特异性配体结合,形成CXCR4/SDF-1轴,促使DTC生长、浸润及转移,致其进展和预后不良。

MFAP2也称为微纤丝相关糖蛋白1,由183个氨基酸组成,它与细胞外基质内的微纤维有关,MFAP2缺陷将引起整合素-基质之间的相互作用减少。MFAP2可通过激活TGF-β/SMAD2/3通路诱导胃癌细胞上皮间质转化[7]。MFAP2表达水平与超声造影参数[达峰时间(time to peak,TTP)、峰值强度(peak intensity,PI)、平均通过时间(mean transit time,MTT)]有显著关系,有助于早期评估甲状腺癌预后[8]。本研究结果表明,分化型甲状腺癌患者肿瘤组织中MFAP2呈高表达,其表达水平与淋巴结转移、肿瘤分化程度、TNM分期及3年总生存率相关,结合Dong S Y等[9]的报道推测MFAP2可能通过促进甲状腺癌细胞的增殖、集落形成、迁移和侵袭能力,降低细胞凋亡率,而促进DTC发生、发展及不良预后。

KLF4属于Krüppel样因子家族中的重要一员,分布于血管内皮、巨噬细胞等中,能够参与细胞周期、细胞增殖、细胞侵袭和转移等生物学进程,在多种肿瘤形成与发展中有重要作用。结直肠癌患者KLF4低表达与总生存率降低相关,KLF4可通过上调p21WAF1/Cip1以及下调细胞周期蛋白D1而抑制结直肠癌细胞增殖[10]。KLF4能参与胃肠道上皮的增殖、分化及肿瘤形成的调节,KLF4在胃癌中扮演抑癌基因角色。KLF4可通过抑制富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(Cysteine rich acidic secretory protein,SPARC)表达来抑制肺癌细胞侵袭。本研究结果显示,DTC组织中KLF4蛋白表达量较癌旁正常组织低,且KLF4低表达与患者淋巴结转移、肿瘤分化程度、TNM分期及3年总生存率均有关,提示KLF4参与DTC发生和发展,并推测KLF4在DTC病理过程中发挥抑癌作用,KLF4低表达可促进肿瘤细胞增殖,其机制可能与调节N-钙粘蛋白、基质金属蛋白酶2/9表达等有关[11]。

绘制ROC曲线发现,CXCR4、MFAP2、KLF4单独或联合预测DTC预后的AUC(95%CI)分别为0.692(0.562～0.823)、0.729(0.590～0.869)、0.766(0.622～0.910)、0.832(0.690～0.975),可见联合预测的效能显著优于单项检测,提示CXCR4、MFAP2、KLF4联合检测有助于预测分化型甲状腺癌预后。

综上所述,分化型甲状腺癌患者肿瘤组织中CXCR4、MFAP2呈高表达,KLF4呈低表达,其表达水平与淋巴结转移、肿瘤分化程度、TNM分期及3年总生存率相关,三者联合检测有助于预测分化型甲状腺癌预后。本研究也有一定缺陷,如随访时间比较短、样本数较少等,未来待完善。