肾经水肿汤对糖尿病肾病大鼠的保护作用及调节机制

左 封, 李 晶, 白梦婷, 吴 悠, 陈伟栋

(湖北省武汉市中西医结合医院肾内科, 湖北 武汉 430030)

糖尿病肾病(Diabetes nephropathy,DN)是一种由慢性高血糖导致的肾脏损伤,是糖尿病(DM)患者常见的并发症之一。DN是终末期肾病(ESRD)的主要原因,在糖尿病患者中发病率和死亡率较高[1]。在病理学上,DN的特征是慢性肾脏炎症和纤维化,导致细胞外基质(ECM)在肾间质中沉积和基底膜增厚。在目前的临床工作中,由于没有治疗DN的有效药物,大多数糖尿病患者最终会发展为终末期肾病。因此,开发治疗DN的新的有效药物对于患者而言至关重要。根据中医观念,糖尿病肾病的证型可分为气虚、血瘀、阴虚、浊湿、痰湿、阳虚、血虚、气滞[2]。临床观察显示,气虚所致血瘀是DN患者最常见的中医证候。因此,补气改善血液循环的中药方剂已常用于DN的治疗[3]。肾经水肿汤(Shenjingshuizhong decoction)是一种调理肾经的中药方剂,有助于利尿消肿与健脾益肾。肾经水肿汤的中药组成如下:黄芪、桂枝、西洋参、茯苓皮、山药、薏苡仁、防风、猪苓、地肤子与车前子。所有药物均归属肾经,具有良好的保护肾脏的功效。有研究指出,肾经水肿汤可以缓解腹膜透析患者的不适症状,提高患者的生活质量[4]。尽管肾经水肿汤在一些研究中显示出对肾脏疾病的潜在益处,但其对DN的作用机制尚不清楚,仍需要进一步研究。因此,本研究探讨肾经水肿汤对DN大鼠的保护作用及调节机制,为肾经水肿汤治疗DN提供实验依据。

1 材料与方法

1.1实验材料及仪器:SPF级12周龄的SD雄性大鼠60只,体质量(200±20)g,购自北京斯贝福生物技术有限公司。肾经水肿汤的中药组成如下:黄芪、桂枝、西洋参、茯苓皮、山药、薏苡仁、防风、猪苓、地肤子与车前子,所有药物均为颗粒剂,购自江阴天江药业有限公司。α-硫辛酸购自南京建成生物有限公司。链脲佐菌素(STZ),无菌柠檬酸缓冲液,3%水合氯醛,非抗凝管,4%多聚甲醛,高碘酸希夫染色液,硫酸,乙醇等购自美国sigma公司。RIPA裂解缓冲液,BCA试剂盒,5%脱脂奶粉,洗涤缓冲液(TBST),PBST缓冲液,ECL试剂盒等购自北京索莱宝公司。PVDF购自美国Invitrogen公司。所有抗体均购自美国Abcam公司。全自动生化分析仪(AU480)购自美国贝克曼公司。倒置显微镜购自日本尼康公司。

1.2实验方法

1.2.1大鼠模型建立与分组处理:所有动物试验均参照《实验动物护理和使用指南》[5]。动物研究获得武汉市中西医结合医院动物伦理与福利委员会的批准(批准号:20220057)。将购入的60只SPF级12周龄的SD雄性大鼠(5只/笼)适应性饲养一周(光暗环境:12h/12h;饲养温度:22℃～24℃;饲养湿度:50%～70%)。所有大鼠可以自由接触足够的食物和水。之后,将大鼠随机分为6组(n=10/组):正常对照组、DN模型组、肾经水肿汤低剂量组(1g/kg)、肾经水肿汤中剂量组(2g/kg)、肾经水肿汤高剂量组(4g/kg)与阳性对照组(α-硫辛酸,60mg/kg)。DN的建模方法参照前人的报道[6]。其中,DN模型组、肾经水肿汤低、中、高剂量组与阳性对照组的50只大鼠通过腹膜内单次注射60mg/kg STZ,72h之后利用尾静脉采血法测定大鼠的血糖水平(血糖浓度 ≥ 16.70mmoL/L则提示DM大鼠建模成功)。3周后测定DM大鼠24h尿蛋白(24h尿蛋白 >30mg则提示DN大鼠建模成功)。正常对照组大鼠则通过腹膜内单次注射等体积的无菌柠檬酸缓冲液。DN建模成功后,肾经水肿汤低剂量(1g/kg)、中剂量(2g/kg)、高剂量(4g/kg)剂量组的30只大鼠饲喂混有相应剂量药物的专用饲料,正常对照组与DN模型组大鼠饲喂正常基础饲料。与此同时,阳性对照组大鼠通过腹膜内注射α-硫辛酸(60mg·kg-1·d-1),1次/d,持续28d。

1.2.2记录大鼠一般情况:在实验干预过程中,对大鼠的精神状态与体重进行观察记录。与此同时,在DN建模成功后第2天与28d干预结束后,分别利用尾静脉采血法测定大鼠的血糖水平并记录为初始血糖与末期血糖。

1.2.3检测大鼠肾功能指标:在实验干预结束后,将大鼠利用3%水合氯醛麻醉并固定。利用非抗凝管收集各组大鼠的外周血,并在2500r/min离心15min后,将得到的血清置于全自动生化分析仪检测血清肌酐(Cr)与血清尿素氮(BUN)。将处理后的各组大鼠安乐死,收集肾脏组织并将其储存在-80℃或石蜡包埋中,用于后续实验。

1.2.4大鼠肾脏组织学检查:收集各组大鼠的肾脏组织,利用生理盐水清洗干净后浸泡于4%多聚甲醛中固定。之后,将组织脱水,透明并包埋到石蜡组织中。将石蜡包埋的肾组织切成5μm厚的切片并用高碘酸希夫(PAS)染色。将组织切片浸泡在1%的高碘酸希夫染色溶液中,处理15min。清洗后,将组织切片浸泡在1%硫酸中进行水解10min。将组织切片在蒸馏水中洗净,以去除水解产物。之后,将组织切片浸入逐渐浓度递增的乙醇,然后用透明剂进行透明处理并封片。使用显微镜观察染色结果(400×放大倍率),并记录所看到的特征。

1.2.5蛋白质免疫印迹测定相关蛋白水平:利用RIPA裂解液裂解各组大鼠的肾脏组织,分离组织中的总蛋白。利用BCA试剂盒评估蛋白质浓度。之后,运用10% SDS-PAGE分离蛋白,并将其转移到PVDF膜上。利用含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液在室温下封闭1h后,加入一抗:抗-促血管生成素1(anti-Ang-1)、抗-激活素样激酶1(anti-ALK1)、抗-转化生长因子-β(anti-TGF-β1)、和anti-β-actin,在4℃下孵育过夜。最后,用PBST清洗3次后加入辣根过氧化物酶标记的二抗并孵育2h。用ECL试剂盒检测蛋白信号并用ImageJ软件进行分析。

2 结 果

2.1肾经水肿汤对大鼠一般情况及体重、血糖的影响:正常对照组大鼠的健康状态良好,毛发油亮,反应灵敏,体型增长明显。DN模型组大鼠饮水摄食量增加,排尿增加,毛发无光泽,行动缓慢,精神萎靡不振,体型消瘦。经过各组药物治疗后,上述症状均有所减轻。在实验干预前各组大鼠的体重无显著性差异(P>0.05)。实验干预后,与正常对照组相比,其余各组大鼠的体重均显著下降(P<0.05)。与DN模型组相比,肾经水肿汤低、中、高剂量组与阳性对照组的体重均显著提高,且具有浓度依赖性(P<0.05)。肾经水肿汤高剂量组的体重与阳性对照组无显著性差异(P>0.05)。此外我们发现,与正常对照组相比,其余各组大鼠的血糖水平均显著提高(P<0.05)。与DN模型组相比,肾经水肿汤低、中、高剂量组与阳性对照组的血糖水平均显著下降,且降糖效果具有浓度依赖性(P<0.05)。肾经水肿汤高剂量组的降糖效果与阳性对照组无显著性差异(P>0.05),见表1。

表1 各组大鼠体重与血糖浓度比较

2.2肾经水肿汤对大鼠肾功能指标的影响:结果显示,与正常对照组相比,其余各组大鼠的Cr与BUN水平均显著提高(P<0.05)。与DN模型组相比,肾经水肿汤低、中、高剂量组与阳性对照组的Cr与BUN水平均显著下降,且具有浓度依赖性(P<0.05)。肾经水肿汤高剂量组的Cr与BUN水平与阳性对照组无显著性差异(P>0.05)。具体见表2。

表2 各组大鼠肾功能指标比较

2.3肾经水肿汤对大鼠肾组织结构的影响:结果显示,与正常对照组相比,其余各组大鼠的肾组织切片均显示间质增生,肾小球基底膜增厚。与DN模型组相比,肾经水肿汤低、中、高剂量组与阳性对照组的肾组织切片间质增生和肾小球基底膜的增厚程度均明显减弱,且具有浓度依赖性。肾经水肿汤高剂量组与阳性对照组无显著性差异。具体见图1。

图1 肾经水肿汤对大鼠肾组织结构的影响

2.4肾经水肿汤对大鼠肾脏组织中Ang-1表达以及TGF-β1/ALK1通路水平的影响:结果显示,与正常对照组相比,DN模型组大鼠的肾脏组织中Ang-1、TGF-β1与ALK1的蛋白表达水平均显著提高(P<0.01)。与DN模型组相比,肾经水肿汤低、中、高剂量组与阳性对照组的肾脏组织中Ang-1、TGF-β1与ALK1的蛋白表达水平均显著下降,且具有浓度依赖性(P<0.05)。肾经水肿汤高剂量组与阳性对照组无显著性差异(P>0.05)。具体见图2。

图2 Ang-1、TGF-β1与ALK1蛋白表达情况分析

3 讨 论

本研究发现,DN模型组大鼠呈现典型症状。经过肾经水肿汤治疗后症状均有所减轻。这说明肾经水肿汤对DN具有一定的治疗作用。长期高血糖会引起肾小球滤过膜的损伤。随着疾病的发展,血清Cr和BUN的升高则表明肾功能的损害加重[7]。本研究发现,与正常对照组相比,DN模型组大鼠的体重均显著下降,血糖水平与血清Cr与BUN水平均显著提高(P<0.05)。与DN模型组相比,肾经水肿汤治疗组的体重均显著提高,血糖水平与血清Cr与BUN水平均显著下降(P<0.05),这说明肾经水肿汤可以控制血糖水平并缓解DN大鼠的肾脏功能损伤。

在DN中,肾小球硬化和基底膜增厚可能导致肾间质纤维化,引起肾小管的结构和功能的改变,进而影响水分和电解质的平衡。傅松波[8]等发现,白藜芦醇可以改善DN大鼠的肾脏超微结构,缓解DN大鼠的肾损伤。我们发现,DN模型组大鼠的肾组织间质增生,肾小球基底膜增厚。与DN模型组相比,肾经水肿汤治疗组的肾组织病变程度均显著减弱(P<0.05)。这说明肾经水肿汤可以缓解DN大鼠的肾脏损伤与肾结构变化,与傅松波[8]等的研究相似。郭晓玲[9]等的研究发现,DN大鼠的肾脏组织中Ang-1的表达显著上调。芪芍胶囊可以抑制DN大鼠肾组织中Ang-1的表达,进而起到肾保护作用。Mohammad等[10]研究发现,二甲双胍可以抑制TGF-β1/ALK1信号通路,进而抑制DN大鼠的肾脏血管生成,并缓解DN大鼠的肾脏超微结构变化。本研究发现,与正常对照组相比,DN模型组大鼠的肾脏组织中Ang-1、TGF-β1与ALK1的蛋白表达水平均显著提高(P<0.01)。这些结果与郭晓玲[9]等的研究相似。此外,我们首次发现与DN模型组相比,肾经水肿汤治疗组的肾脏组织中Ang-1、TGF-β1与ALK1的蛋白表达水平均显著下降(P<0.05)。这说明肾经水肿汤通过抑制TGF-β1/ALK1信号通路进而降低DN大鼠的肾脏血管生成,与Mohammad等[10]的研究相呼应。

本文结果表明,肾经水肿汤通过抑制TGF-β1/ALK1信号通路进而降低DN大鼠的血糖水平、肾功能损伤、肾脏血管生成与肾结构变化。证实肾经水肿汤可能是治疗DN的有效方剂。