DCLK1单克隆抗体在结直肠癌中的表达以及影响因素分析

杜巍，高丹丹，许兴路，于玲，王杨，解谦

1.哈尔滨工业大学附属黑龙江省医院放射免疫特检科，黑龙江哈尔滨 150036；2.哈尔滨市红十字中心医院检验科，黑龙江哈尔滨 150036；3.哈尔滨工业大学附属黑龙江省医院实验诊断部，黑龙江哈尔滨 150036；4.哈尔滨工业大学附属黑龙江省医院儿科，黑龙江哈尔滨 150036

结直肠癌属于临床常见的消化系统恶性肿瘤，近年来，受环境问题、人口老龄化加重等因素的影响，结直肠癌发病率不断升高[1-2]。手术为结直肠癌的根治手段，能够祛除病灶，降低肿瘤病灶复发风险以及转移风险，对于延长患者生存周期具有非常重要的意义，但是中晚期结直肠癌患者需要配合放化疗等手段以进一步提高病情控制效果并有效延长患者生存周期，早期准确诊断和治疗对于改善患者生存质量有重要意义[3-4]。Doublecortin样激酶-1（Doublecortin Like Disease 1, DCLK1）属于Doublecortin家族及蛋白激酶家族成员。研究表明，DCLK1在结直肠细胞系中存在癌症干细胞样特征，与病情进展及预后存在重要关联[5]。本研究选取2018年7月—2022年6月哈尔滨工业大学附属黑龙江省立医院收治的73例结直肠癌患者作为研究对象，分析DCLK1单克隆抗体在结直肠癌中的表达情况以及与患者预后相关性，以期为临床评估患者病情严重程度以及预测患者预后提供指导，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取本院收治的73例结直肠癌患者作为研究对象，其中男44例，女29例；年龄27～79岁，平均（60.16±5.04）岁。根据患者肿瘤组织中DCLK1表达水平将其分为DCLK1低表达组与DCLK1高表达组，分别纳入例数为31例、42例。本研究经医院医学伦理委员会批准，患者与家属知情同意（SYYLLBA202161）。

1.2 纳入与排除标准

纳入标准：①经纤维结肠镜检查及病理活检确诊病情；②具有非常完整的临床资料；③术前未接受过化疗、放疗等治疗；④年龄>18岁。

排除标准：①处于妊娠期、哺乳期女性患者；②合并其他恶性病变或者系统性疾病患者；③伴精神、智力、理解或者沟通能力障碍患者；④DCLK1检测结果不明确或者无法对检测结果进行准确判定患者。

1.3 方法

肿瘤组织中DCLK1单克隆抗体检测方法如下：针对结直肠癌石蜡切片实施脱蜡，直至脱水，以乙醇实施梯度脱水。切片染色通过Harris苏木素进行，时间为3～8 min，然后于自来水下冲洗，采用1%盐酸乙醇进行分化，数秒后以自来水进行冲洗，返蓝操作通过0.6%氨水实施，返蓝完成后在流水下冲洗。切片应用伊红染液对切片实施持续染色（1～3 min），脱水后实施封片操作，通过乙醇取得梯度脱水效果。将切片稍晾干，然后脱水封片，封片采用中性树胶，在显微镜下读片后拍照。将直径为4 μm的结直肠癌组织切片以石蜡包埋，烤片1 h，然后在室温状态下放置，连续浸泡15 min。通过罗氏全自动免疫组化仪上实施切片运动，程序如下：脱蜡15 min后通过抗原修复缓冲液使pH至8.5，然后持续修复30 min，以血清实施封闭（15 min），将一抗100 μl滴入其中，在37℃温度下连续孵育30 min，通过二抗孵育，时间为20 min，然后DAB，时间为6 min，苏木素3 min，返蓝液3 min。对切片进行梯度乙醇脱水，然后实施干燥及二甲苯透明，通过中性树胶封片，在显微镜下读片并拍照。观察细胞质颜色，若可见棕黄色或者黄色即为染色。无染色计0分，轻微染色计1分，中度染色计2分，强染色计算3分。如下为染色面积评估标准：无染色计0分；染色细胞占0%～＜30%计1分；染色细胞占30%～＜60%计2分；染色细胞≥60%计3分。最终得分即为染色深浅得分×染色面积得分，以评分>4分为高表达。

1.4 观察指标

①分析肿瘤组织中DCLK1表达水平与结直肠癌患者病理特征，包括患者的年龄、性别、肿瘤分期（Tumor Node Metastasis, TNM）分期、淋巴结转移、肿瘤直径、浸润深度、有无脉管、是否出现肿瘤病灶远处转移以及肿瘤分化程度。

②分析肿瘤组织中DCLK1表达水平影响因素。

1.5 统计方法

采用SPSS 23.0统计学软件分析数据，肿瘤组织中DCLK1表达水平与结直肠癌患者病理特征为计数资料，以例数（n）和率（%）表示，进行χ2检验。筛选影响肿瘤组织中DCLK1高表达水平的相关因素，选择单因素分析中P＜0.05的变量进行多因素Logistic回归分析，计算相对危险度（OR）和95%可信区间（95%CI）。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肿瘤组织中DCLK1表达水平与结直肠癌患者病理特征分析

DCLK1高表达患者共计42例，DCLK1低表达患者共计31例，DCLK1高表达组与DCLK1低表达组患者年龄、性别对比，差异无统计学意义（P均＞0.05）；两组患者肿瘤直径、肿瘤组织TNM分期、浸润深度、淋巴结是否转移、有无脉管、肿瘤分化程度、肿瘤病灶是否远处转移对比，差异有统计学意义（P均＜0.05）。见表1。

表1 肿瘤组织中DCLK1表达水平与结直肠癌患者病理特征分析[n(%)]

2.2 肿瘤组织中DCLK1高表达水平影响因素分析

以DCLK1高表达组与DCLK1低表达组具有统计学意义的单因素为因变量，肿瘤组织中DCLK1高表达水平为自变量实施多因素Logistic回归分析。研究结果显示，肿瘤组织中DCLK1高表达水平影响因素包括TNM分期、淋巴结转移、肿瘤病灶远处转移、肿瘤直径、浸润深度、肿瘤分化程度（P均＜0.05）。见表2。

表2 肿瘤组织中DCLK1表达水平影响因素分析

3 讨论

结直肠癌与人们生活方式和饮食结构等因素存在关联，结直肠癌发生率呈升高趋势，现阶段，结直肠癌诊治水平已经获得了显著的进步，患者生存周期获得了延长，但是患者预后以及远期生存率仍然不佳。侵入性内径检查联合病理活检为临床诊断结直肠癌的主要手段，但是作为有创性检查，上述检查方式应用受限，因此，有必要需求辅助性诊断手段以提高结直肠癌检出率。

肿瘤干细胞在肿瘤发生、发展以及转移和复发中发挥着至关重要的作用，癌症的治疗过程中如不能使癌症干细胞得到有效清除，癌症很容易发生复发和转移。DCLK1可作为肿瘤干细胞的特异性表面标志物，开发抗DCLK1特异性抗体对于肿瘤干细胞的特异性诊断和治疗具有重要的意义。人类染色体13q13上可见DCLK1编码基因，乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌等组织上皮细胞的基质和细胞质中均可检出DCLK1，不但与肿瘤病灶转移存在关联，同时也会影响患者预后。结直肠癌细胞系中DCLK1存在癌症干细胞样特征，表明DCLK1在结直肠癌早期诊断具有一定的价值，可对肿瘤复发及预后等相关情况进行预测[6-7]。

结直肠癌在全世界范围内均属于高度病态疾病及致命性疾病，尽管P53、KRAS及APC等多种致癌基因与肿瘤抑制基因被发现，但是受低频率体细胞突变等因素的影响，导致结肠癌存在异质性，此外，受潜在功能突变等因素的影响，结肠癌临床完全治愈率极低，严重危及患者生命安全[8]。部分大肠癌可通过子代组成细胞表型变异，干细胞存在为癌症发生和进展的重要原因，在结直肠癌增殖与转移过程中均能够发挥重要的驱动作用。肿瘤干细胞可产生其他肿瘤细胞，DCLK1为肿瘤干细胞标志，可通过抑制肿瘤生长的微小RNA（miRNA）及Let-7a含量增加，进而可使促进肿瘤发生的上皮间质转化及肿瘤干细胞基因的转录因子表达降低[9]。

DCLK1在神经元迁移、神经元凋亡、神经元逆性运输及凋亡等过程中均可发挥作用，其微管聚合活动能不受其他蛋白激酶活性的影响，DCLK1在钙信号通路控制发育中的大脑神经元迁移过程中以及成熟神经系统发挥过程中可能发挥了一定的参与作用[10-11]。与正常人结肠黏膜相比，结直肠癌患者DCLK1表达水平显著升高。DCLK1为存在于癌症及正常干细胞中的蛋白质，可通过原癌基因c-Myc基因及pri-let-7a miRNA基因的调控作用促进肿瘤发生和发展。肿瘤干细胞可生成其他肿瘤细胞，与亲代细胞相比，肿瘤干细胞的能力显著更强。肿瘤干细胞中的DCLK1上调可能与细胞增殖能力显著增强存在关联[12]。本研究中，多因素Logistic回归分析研究结果表明，肿瘤组织中DCLK1高表达水平影响因素包括浸润深度、淋巴结转移、肿瘤病灶远处转移、TNM分期、肿瘤直径、肿瘤分化程度（P均＜0.05）。

现阶段，临床关于DCLK1在肿瘤发展重要环节中所发挥的重要作用尚缺乏了解，DCLK1表达上调在结直肠肿瘤中可能为早期事件，高DCLK1表达不但能够于原发性肿瘤中检出，同时也能够于远端转移中检出[13]。DCLK1在结直肠癌、食管癌以及胰腺癌等多种肿瘤细胞中表达水平较高，而且与肿瘤生长、侵袭以及转移等存在密切关联，TNM分期、浸润深度以及淋巴结转移、肿瘤病灶远处转移、肿瘤分化程度等指标均能够反映肿瘤生长和侵袭情况，DCLK1可对肿瘤细胞凋亡相关蛋白表达发挥调控作用，对结直肠肿瘤凋亡可产生影响，同时也会影响化疗敏感度。贾长河等[14]研究发现，DCLK1在胃癌组织中的表达水平显著高于癌旁正常组织，DCLK1高表达与胃癌患者临床分期、淋巴转移、脉管侵犯、神经侵犯以及肿瘤浸润程度、分化程度存在相关性。

综上所述，肿瘤组织中DCLK1高表达水平影响因素较多，包括淋巴结转移、浸润深度、TNM分期、肿瘤直径、肿瘤病灶远处转移、肿瘤分化程度等，临床可根据相关影响因素对DCLK1单克隆抗体表达水平进行判断。本研究的局限性主要包括样本量少和研究时间短等，未来应在条件允许的情况下增加样本量并延长研究时间以深入验证和分析DCLK1单克隆抗体在结肠癌中的表达情况，以期为临床评估患者病情与预后提供一定的指导。