无醇酵母的筛选及其发酵性能研究

万秀娟，姜宗祥，赵玉祥，陈 嵘，贺 扬

（青岛啤酒股份有限公司，啤酒生物发酵工程国家重点实验室，山东青岛 266100）

随着人们对酒精危害认识的加深，以及消费者对健康的关注越来越多，无醇啤酒渐渐走进人们的生活，受到消费者的青睐[1]。与传统啤酒相比，无醇啤酒的生产工艺流程具有较大差异，从而使得其口感与传统啤酒存在差异。目前，生产无醇啤酒主要有两大类的经典方法，分别是物理方法和生物方法。物理方法是在啤酒发酵结束后去除酒精，通常使用热处理去除啤酒中的酒精（也就是脱醇），如真空蒸馏、膜过滤（透析、反渗透）等；生物方法是在发酵过程中尽量控制酒精的产生量，如冷接触和限制发酵等[2]。使用特殊酵母进行无醇啤酒的生产是生物方法中的一种，这种方法主要是利用酵母对糖的利用情况不同，根据需要，可配合相应的糖化工艺，使得发酵后酒液的酒精含量较低，符合无醇啤酒的要求。与传统酿造酵母相比，“特殊”酵母因无法发酵麦汁中的某些可发酵性糖，倾向于产生较少量的乙醇。例如已在商业上应用多年的非酿酒酵母Saccharomycodes ludwigii[3]。

本研究以Saccharomycodes ludwigii酵母TTNA-01 为对照酵母，通过糖利用试验、酒花耐受试验、酒精度、风味、成熟度等指标，进行无醇酵母的筛选，从多株酵母中筛选出1 株无醇酵母TTNA-05，通过发酵试验，该酵母在原麦汁浓度7°P 时，发酵产生酒精浓度≤0.5 %vol，符合无醇啤酒的要求。并通过DOE 试验对TTNA-01、TTNA-05 酵母进行发酵工艺优化，根据优化工艺，使用两株酵母分别进行无醇啤酒的生产，所得无醇啤酒没有麦汁味，TTNA-01 具有果香味，TTNA-05 具有轻微4-VG味，可作为新口味的无醇啤酒的生产菌株。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

原料及菌种：酵母，本公司保藏；麦芽、酒花，本公司使用。

耗材：30 %异构α-酸钾盐酒花浸膏，巴特哈斯；YPD 培养基，生工；新型微生物微量生化鉴定管，环凯生物。

仪器设备：离心机，英国SIGMA 公司；显微镜，日本OLYMPUS 公司；涡旋振荡器，IKA 公司；Lambda 2S 分光光度计，PERKIN ELMER 公司；培养箱，德国宾德；啤酒全自动分析仪，奥地利ANTON PAAR公司；气相色谱仪，美国GE公司。

1.2 实验方法

1.2.1 麦汁制备

麦芽粉碎后与水按照料水比1∶4 混合，首先在50 ℃糖化40 min，同时开始搅拌，随后升温至70 ℃进行第二段糖化，用碘液检验糖化程度，直到碘液与糖化液不发生蓝色反应，糖化结束。煮沸过程分三次添加酒花，添加量为0.08 %，第一次在麦汁煮沸10 min 时，加入总量10%，第二次在煮沸35 min时，加总量50 %，第三次在煮沸70 min 时，加入总量40%。一共煮90 min。

1.2.2 酵母扩培

酵母扩培流程：酵母活化—小试管培养（5 mL）—大试管培养（10 mL）—小三角瓶（220 mL）—大三角瓶（2200 mL）—酵母回收。

将待测酵母活化后分别接入小试管、大试管、小三角瓶、大三角瓶进行培养，25 ℃，36 h。将大三角瓶中培养好的酵母降温至4 ℃澄清4 h，倒去上清液于4000 r/min离心10 min，进行酵母回收。

1.2.3 酵母糖利用实验

将活化好的酵母取50 μL 分别加入到含有不同碳源的微生物微量生化鉴定管中，加全塞，25 ℃培养1～3 d 观察颜色变化（根据颜色变化情况确定酵母是否能够利用该种碳源）。

1.2.4 酵母酒花耐受实验

将活化好的酵母按照1∶100 的比例添加到不同苦味值的YPD 培养基中，每梯度进行平行试验，25 ℃培养3 d，检测OD 值（通过OD 值的变化来判断酵母在该苦味值下的生长情况），每组试验进行3次平行。

1.2.5 其他检测

发酵度、酒精度测定：啤酒全自动分析仪检测；双乙酰含量的测定：气相色谱法[4]；风味物质的测定：气相色谱法[4]。

1.2.6 发酵试验

2 L 发酵瓶中装7 °P 麦汁1.6 L，接入酵母泥，使满罐酵母数控制在10×106个/mL，20 ℃发酵。

1.2.7 无醇酵母DOE试验及验证

1.2.7.1 无醇酵母DOE试验

为进一步了解TTNA-01、TTNA-05 酵母的发酵性能，确定最佳无醇啤酒生产工艺，设计实验方案：酵母：TTNA-01、TTNA-05，实验室扩培；麦汁：13°P 生产麦汁；发酵温度：12～20 ℃；充氧量：180 r/min，10～30 min；发酵时间：3～5 d；酵母数：3×106个/mL～10×106个/mL；规模：0.5 L。

1.2.7.2 验证试验

通过该试验验证DOE 试验确定的发酵工艺的准确性。试验方案：采用DOE 试验确定的酵母及工艺进行发酵试验。

2 结果与分析

2.1 酵母糖利用

不同酵母对糖的利用情况是不同的，利用微生物微量生化鉴定管，鉴定酵母对麦汁中不同糖是否能够利用，可以了解该酵母对糖的利用情况，初步判定酵母是否可以用于无醇啤酒的生产。

根据1.2.3 实验方法对7 株酵母的糖利用情况进行检测，检测结果见表1。由表1 结果可看出不同酵母糖利用存在差异，TTNA-02、TTNA-03、TTNA-04 仅能利用麦汁中的葡萄糖及果糖；TTNA-01、TTNA-05 酵母能利用麦汁中的葡萄糖、果糖和蔗糖；TTNA-06、TTNA-07 能利用麦汁中的葡萄糖、果糖、蔗糖和麦芽糖。

表1 不同酵母可利用麦汁中糖的种类

2.2 酵母酒花耐受

因为收集的酵母，大部分都不是酿酒酵母，所以其对酒花的耐受能力是未知的，为了便于了解酵母的酒花耐受能力，更好的应用于啤酒生产，通过不同苦味值的（苦味质梯度设置为0 BU、10 BU、20 BU、30 BU、50 BU、100 BU）单因子试验，确定7株酵母对酒花物质的耐受能力。

根据1.2.4 实验方法对不同酵母不同苦味值下的生长情况进行检测，将检测结果取平均值减去空白后得到数据表2。

表2 酵母在不同苦味值下OD值

由表2 数据可以看出，TTNA-04 酵母在苦味值达到50 BU 时生长受到明显抑制，其他6 株酵母在苦味值达到100 BU时生长情况无明显影响。

2.3 发酵试验

为了进一步确定酵母的发酵性能，筛选出优良的无醇酵母菌株，使用步骤1.2.2 回收的酵母进行2 L 发酵试验，试验中除添加酵母不同，麦汁、充氧及其他工艺控制均相同。

表3 是发酵后冷贮酒的发酵度、酒精度及成熟度指标，由表3 数据可以看出，采用7°P 无醇麦汁，5 株酵母TTNA-01、TTNA-02、TTNA-03、TTNA-04、TTNA-05 酒精度在0.5 %vol 以下，符合无醇啤酒的要求；TTNA-06、TTNA-07 酵母酒精度在0.5%vol～2.5%vol 之间可以作为低醇酵母。酒液的发酵度、酒精度与酵母对糖的利用明显相关。从成熟度数据来看，TTNA-01、TTNA-03、TTNA-05、TTNA-06成熟度较好。

表3 冷贮酒发酵度、酒精度及成熟度

表4 是不同酵母发酵后冷贮酒的风味指标，由表4数据可以看出，无醇酵母：TTNA-04酵母醇、酯产量非常低，经品评冷贮酒麦汁味明显；TTNA-03酵母酯产量较高，经品评冷贮酒酯香过于突出，酒体不协调；TTNA-01、TTNA-05 酵母醇产量较高；低醇酵母：TTNA-06 酵母醇、酯产量均较高，TTNA-07醇产量较高。综合发酵性能、风味指标及品评结果，TTNA-01、TTNA-05 较为适合生产无醇啤酒，TTNA-06酵母生产低醇啤酒较有优势。

表4 冷贮酒醇酯检测

2.4 无醇酵母DOE试验

使用Minitab 软件进行5 因子2 水平分辨度为V的试验设计，试验设计见表5。

表5 DOE试验设计

表6 为DOE 试验发酵结果，由表6 数据可以看出，所有发酵试验的冷贮酒发酵度均在11%左右，当麦汁浓度7°P 时酒精度均≤0.5%，冷贮酒的成熟度指标可以接受。

表6 DOE试验发酵数据

因发酵后酒精产量均能满足无醇啤酒的要求，因此进行DOE 发酵试验优化时不考虑酒精产量。当不考虑酒精产量时，向总醇、总酯望大，乙醛、双乙酰望小的方向进行优化，优化结果见图1，由图1结果可以看出，采用TTNA-01 酵母，满罐酵母数10×106个/mL，充氧10 min，20 ℃发酵5 d，该结果最优。

图1 DOE试验优化图（包含TTNA-01、TTNA-05数据）

提取TTNA-01 酵母的发酵数据，针对TTNA-01 酵母不考虑酒精产量，向总醇、总酯望大，乙醛、双乙酰望小的方向进行优化，得到优化结果见图2，结果为满罐酵母数10×106个/mL，充氧量10 min，20 ℃发酵5 d，与无醇酵母优化结果一致。

图2 DOE试验优化图（仅TTNA-01数据）

提取TTNA-05 酵母的发酵数据，针对TTNA-05 酵母不考虑酒精产量，向总醇、总酯望大，乙醛、双乙酰望小的方向进行优化得到优化结果见图3，结果为满罐酵母数7.5×106个/mL，充氧量10 min，20 ℃发酵5 d。

图3 DOE试验优化图（仅TTNA-05数据）

通过进行菌种、酵母数、充氧量、发酵温度、发酵时间5因子两水平DOE试验，分析数据优化得到工艺为：采用TTNA-01 酵母，满罐酵母数10×106个/mL，充氧10 min，20 ℃发酵5 d。

针对TTNA-05 酵母数据进行分析，优化得到工艺为：满罐酵母数7.5×106个/mL，充氧量10 min，20 ℃发酵5 d。

2.5 验证试验

酵母：TTNA-01、TTNA-05，实验室扩培；麦汁：工厂麦汁；满罐酵母数：TTNA-01 酵母10×106个/mL；TTNA-05 酵母7.5×106个/mL；工艺：充氧180 r/min，10 min，20 ℃发酵5 d。

规模：2 L。

验证试验结果如表7、表8 所示，由表7、表8 数据可以看出，当麦汁浓度7 °P 时，TTNA-01 有果香味，TTNA-05 酵母有轻微4-VG 味，酒精度≤0.5%vol，符合无醇啤酒的要求。

表7 验证试验冷贮酒发酵度、酒精度及成熟度

表8 验证试验冷贮酒醇酯 (mg/L)

3 结论

综合生理生化试验结果、酒精度、成熟度、总醇、总酯等指标，TTNA-01、TTNA-05 酵母适合生产无醇啤酒。经过发酵工艺研究充分了解菌株性能，TTNA-01、TTNA-05 酵母在满罐酵母数3×106个/mL～10×106个/m，发酵温度12～20 ℃，发酵时间3～5 d 时，发酵生产麦汁，酒精度均符合无醇啤酒的要求。

通过DOE试验，优化得到结果：采用TTNA-01酵母，满罐酵母数10×106个/mL，充氧量10 min，20 ℃发酵5 d，最佳。经过发酵试验验证，当麦汁浓度7°P 时，TTNA-01 有果香味，TTNA-05 酵母有轻微4-VG 味，酒精度≤0.5 %vol，符合无醇啤酒的要求。因此采用TTNA-01、TTNA-05 两株酵母进行无醇啤酒的生产是可行的。