产气荚膜梭菌α－毒素基因数字ＰＣＲ 方法的建立及其在标准物质研制方面的应用

张铭洋 张喜悦 赵格 曲志娜 高宏伟 孙敏 程慧敏 徐佳微 王君玮 邹明

摘要：产气荚膜梭菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）是一种重要的人兽共患病原菌，α－毒素是其分子生物学检测的主要靶标。 试验选取Ｃｌｐｅｒ 引物及探针建立微滴式数字ＰＣＲ（ｄｒｏｐｌｅｔ ｄｉｇｔｉａｌ ＰＣＲ，ｄｄＰＣＲ）方法，最佳引物浓度０.８５ μｍｏｌ/ Ｌ，探针浓度为０.３ μｍｏｌ/ Ｌ，退火温度为６０ ℃。 利用建立的ｄｄＰＣＲ 方法检测单核细胞增生李斯特菌、沙门氏菌、大肠杆菌、肠球菌、金黄色葡萄球菌、弯曲杆菌的ＤＮＡ，结果均为阴性，表明该方法具有较好的特异性。 合成产气荚膜梭菌α－毒素基因，制成ＤＮＡ 标准品，选取３ 个稀释梯度的标准品进行重复试验，组内和组间变异系数均小于５％，证明该方法具有较好的重复性。 采用７ 个稀释梯度的标准品进行重复检测，计算出该方法的检测限为１２.３９ ｃｏｐｉｅｓ/ μＬ，定量限为３３.９７ ｃｏｐｉｅｓ/ μＬ。 通过对６８ 份临床样品进行检测，证实该方法可用于临床，且用于检测质粒ＤＮＡ 时无明显的基质效应。 应用ｄｄＰＣＲ 方法对标准品进行均匀性和稳定性检验，并联合９ 家实验室进行定值，最终获得了国家市场监督管理总局颁发的标准物质证书（ＧＢＷ（Ｅ）０９１２３７）。 α－毒素基因ｄｄＰＣＲ 方法的建立和ＤＮＡ 标准物的研制，为产气荚膜梭菌分子生物学检测试剂的标准化奠定了基础。

关键词：产气荚膜梭菌；ｄｄＰＣＲ；α－毒素基因；标准物质；特异性；灵敏度；可重复性；定值

中图分类号：Ｓ８５２.６１文献标识号：Ａ文章编号：１００１－４９４２（２０２４）０１－０１５６－０８

微滴式数字ＰＣＲ （ ｄｒｏｐｌｅｔ ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ，ｄｄＰＣＲ）是近年来迅速发展起来的一项定量分析技术，能够实现对靶基因的精准定量检测。 数字ＰＣＲ 的概念由Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ 等[１] 首次提出，他们在检测大肠癌患者的Ｋ－ＲＡＳ 基因突变时，进行了微升级的ＰＣＲ 扩增，分别用不同荧光检测突变基因和正常基因，通过计算突变基因和正常基因的比例得出突变率。 随着生物技术的不断发展与优化，ＰＣＲ 技术从普通ＰＣＲ 逐渐发展为荧光定量ＰＣＲ，目前的ｄｄＰＣＲ 属于第三代ＰＣＲ。 ｄｄＰＣＲ 技术通过对样品进行微滴化处理，经ＰＣＲ 扩增后对所有微滴进行逐个检测，有荧光信号的判读为１，无荧光信号的判读为０，再根据泊松分布原理和阳性微滴的数量与比例可得出目的分子的起始拷貝数。 与传统ＰＣＲ 及荧光定量ＰＣＲ 相比，ｄｄＰＣＲ具有样本需求量低、绝对定量以及高灵敏度、高重复性、高耐受性等优势[２－４] 。 目前，该技术已广泛应用于转基因生物、致病菌、病毒、食品安全等领域。

产气荚膜梭菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ） 广泛分布于土壤、污水、饲料和动物肠道中，可导致动物的坏死性肠炎、肠毒血症，以及人类的腹泻和食物中毒等疾病[１－２] 。 近年来，关于产气荚膜梭菌分子生物学诊断方法的报道较多，但多为传统的ＰＣＲ 和荧光定量ＰＣＲ 方法，使用的靶基因均为α－毒素基因。 随着产气荚膜梭菌分子生物学检测试剂的广泛应用，对标准物质研发的需求也越来越强烈。 标准物质可以满足检测结果标准化的需求，因此，本研究旨在建立产气荚膜梭菌α－毒素基因ｄｄＰＣＲ 检测方法，并应用于质粒标准物质的研发。

１ 材料与方法

１.１ 供试菌株及样品

产气荚膜梭菌（ＡＴＣＣ１３１２４）、单核细胞增生李斯特菌（ＡＴＣＣ１９１１１）、沙门氏菌（ＡＴＣＣ１４０２８）、大肠杆菌（ＡＴＣＣ２５９２２）、肠球菌（ＡＴＣＣ２９２１２）、金黄色葡萄球菌（ＡＴＣＣ２９２１３）、弯曲杆菌（ＡＴＣＣ３３５５９）均由国家兽医微生物菌（毒）种保藏中心动物卫生与流行病学分中心保存。 产气荚膜梭菌阳性病料由中国动物卫生与流行病学中心致病微生物监测室保存。

１.２ 试剂和仪器

ｄｄＰＣＲ 探针法超预混液（不含ｄＵＴＰ）、微滴发生油购自北京汇力宏业生物科技有限公司。α－毒素基因、引物和探针序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。 微滴式数字ＰＣＲ 检测系统（伯乐ＱＸ２００，美国）。

１.３ 试验设计与方法

１.３.１ ｄｄＰＣＲ 方法的建立 参照Ｇｒａｕ－Ｒｏｍａ[５] 、Ｘｕ[６] 等的方法分别合成２ 对引物和探针（表１）。

分别使用上述２ 对引物建立ｄｄＰＣＲ 方法并进行反应条件优化。 引物和探针分别设置４ 个浓度梯度，其中１０ μｍｏｌ/ Ｌ 引物加样量设置为：１.３、１.５、１.７、１.９ μＬ；１０ μｍｏｌ/ Ｌ 探针加样量设置为：０.３、０.６、０.９、１.２ μＬ。 退火温度设置为５６、５８、６０、６２ ℃。通过比较ｄｄＰＣＲ 的检测拷贝数、微滴生成数、微滴分布状态、微滴荧光信号的强度确定最佳反应条件。

１.３.２ 特异性、重复性、检出限和定量限试验 分别以产气荚膜梭菌、单核细胞增生李斯特菌、沙门氏菌、大肠杆菌、肠球菌和金黄色葡萄球菌的ＤＮＡ 为模板， 用产气荚膜梭菌α － 毒素基因ｄｄＰＣＲ 方法检测以评价其特异性。 选取３ 个浓度梯度（１０１、１０２、１０３ ｃｏｐｉｅｓ/ μＬ） 的标准品ＤＮＡ为模板，在间隔第７ 天和第１４ 天分别进行重复试验，每个浓度设３ 个重复，记录各次试验的拷贝数，并分析组内和组间的变异系数，以检测该方法的重复性。 参考?分析方法检出限和定量限的评估?（ＧＢ/ Ｔ ２７４１５—２０１３）[７] 中的方法进行检出限（ＩＤＥ）和定量限（ＩＱＥ）的测定。 以７ 个浓度梯度（１０－１、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５ ｃｏｐｉｅｓ/ μＬ）的产气荚膜梭菌α－毒素基因质粒标准品ＤＮＡ 为模板，每个梯度重复检测９ 次，用产气荚膜梭菌α－毒素基因的ｄｄＰＣＲ 方法对其扩增，评估方法的检出限、定量限和动态范围。

１.３.３ ｄｄＰＣＲ 方法的临床应用及基质效应评估

取实验室保存的６８ 份临床阳性病料，其中产气荚膜梭菌阳性病料３８ 份，沙门氏菌、大肠杆菌、肠球菌、单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌、弯曲杆菌阳性病料各５ 份，提取ＤＮＡ 作为临床样本进行产气荚膜梭菌α－毒素基因ｄｄＰＣＲ 方法鉴定。 依据?基质效应与互通性评估指南?（ＷＳ/ Ｔ３５６—２０１１）[８] 中的方法对制备的标准物质进行基质效应与互通性评估验证。 选取产气荚膜梭菌临床阳性样本２０ 份，浓度在１０２ ～ １０４ ｃｏｐｉｅｓ/ μＬ间随机分布。 准备５ 份制备样本，将制备样本与临床样本随机穿插排列，使用ｄｄＰＣＲ 方法测定所有样本。

１.３.４ 候选标准物质的制备 通过ＮＣＢＩ 网站Ｂｌａｓｔ 比对，合成具有代表性的产气荚膜梭菌α－ｔｏｘｉｎ 基因（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＹ２７７７２４.１） 片段，克隆至ｐＵＣ５７－α－ｔｏｘｉｎ 质粒并转化Ｅ. ｃｏｌｉ Ｔｏｐ １０ 感受态细胞。 经扩大培养后提取质粒备用。 应用ＫｐｎⅠ（ＮＥＢ，美国）对质粒进行线性化处理，反应体系为２ μＬ ｃｕｔｓｍａｒｔ、３ μＬ ＫｐｎⅠ、５ μＬ ｄｄＨ２Ｏ、１０ μＬ质粒（５３.６５ ｎｇ/ μＬ），３７ ℃水浴３ ｈ。 回收后的线性化质粒，稀释后分装作为候选标准物质，－８０ ℃保存备用。

１.３.５ 候选标准物质的鉴定及检验 对产气荚膜梭菌α－毒素基因质粒进行常规ＰＣＲ 鉴定、双酶切和测序鉴定，并对其进行均匀性和稳定性检验，鉴定方法参照文献[９]进行。

１.３.６ 定值 选择９ 家具备认可资质的实验室，对候选标准物质进行联合定值。 对测得的数据进行正态分布检验、组内可疑值检验、组间等精度检验以及各组平均值之间的ｔ 检验，并计算样品的不确定度，对候选标准物质定值，并通过有证标准物质评估实验室定值的稳定性[７，９] 。

２ 结果与分析

２.１ ｄｄＰＣＲ 方法的建立

分别使用２ 对引物建立ｄｄＰＣＲ 方法，结果Ｃｌｐｅｒ 引物探针具有更好的特异性，故在本研究中，使用该引物探针进行目标基因的扩增。 对引物和探针的浓度进行优化，结果１０ μｍｏｌ/ Ｌ 引物的用量为１.７ μＬ、１０ μｍｏｌ/ Ｌ 探针的用量为０.６μＬ，即反应浓度分别为０.８５ μｍｏｌ/ Ｌ 和０.３ μｍｏｌ/ Ｌ时，ｄｄＰＣＲ 检测拷贝数最多，微滴分布状态、微滴荧光信号的强度也均较好（圖１Ａ）。 退火温度优化结果显示，６０ ℃ 时特异性最好，且信号强度较强（图１Ｂ）。最终建立的ｄｄＰＣＲ 方法，主要包括微滴生成、ＰＣＲ 扩增和微滴读取３ 个步骤。 ①微滴生成。 反应体系为ｓｕｐｅｒｍｉｘ １０ μＬ、上、下游引物（１０ μｍｏｌ/ Ｌ） 各１.７ μＬ、探针（１０ μｍｏｌ/ Ｌ） ０.６μＬ、模板１ μＬ、ｄｄＨ２Ｏ ５.０ μＬ，加入至微滴生成卡的ｓａｍｐｌｅ 孔；在微滴生成卡的ｏｉｌ 孔中加入７０ μＬ微滴生成油；将生成卡放入微滴生成仪，生成微滴。 ②ＰＣＲ 扩增。 将生成的微滴转移至９６ 孔板，盖膜后放入热封仪封膜；将封好膜的９６ 孔板放入ＰＣＲ 仪进行扩增；ＰＣＲ 扩增程序为：５０ ℃ ２ｍｉｎ；９５ ℃ １０ ｍｉｎ；９５ ℃ ３０ ｓ，６０ ℃ １ ｍｉｎ，４０ 个循环；９８ ℃ １０ ｍｉｎ，４ ℃ ６０ ｍｉｎ。 ③微滴读取。 扩增完毕后将９６ 板转移至ＱＸ２００ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｒｅａｄｅｒ 微滴读取仪上进行微滴读取。 在以上确定的反应条件下，阴、阳性微滴划分阈值划定在荧光强度为２ ０００的位置。

加样说明参见表２。

２.２ 特异性、重复性、检出限和定量限结果

分别以单核细胞增生李斯特菌、沙门氏菌、大肠杆菌、肠球菌、弯曲杆菌、金黄色葡萄球菌的ＤＮＡ 为模板，用建立的产气荚膜梭菌α－毒素基因ｄｄＰＣＲ 方法检测，结果均为阴性（图２），表明特异性较好。

选取３ 个浓度梯度（１０１、１０２、１０３ ｃｏｐｉｅｓ/ μＬ）的标准品ＤＮＡ 为模板，分别在第１、７、１４ 天进行重复试验，每个梯度设３ 个平行，记录各次试验的拷贝数，并统计分析组内和组间的变异系数。 结果３个梯度标准品的组内变异系数为０.７３％ ～３.１７％，组间变异系数为３.３６％ ～４.２７％（表３），重复性和重现性较好。

采用７ 个浓度梯度（１０－１、１００、１０１、１０２、１０３、１０４ｃｏｐｉｅｓ/ μＬ 和１０５ ｃｏｐｉｅｓ/ μＬ）的产气荚膜梭菌α－毒素基因质粒ＤＮＡ 进行检测。 每个稀释度３个重复。 结果（图３）表明，ｄｄＰＣＲ 反应产生的微滴数量超过１０ ０００ 个，当稀释度为１０１ ～１０４时，产气荚膜梭菌α－毒素基因拷贝数与浓度之间呈良好的线性关系，可绘制标准曲线（图４）。 标准曲线方程为ｙ＝ ４.３１９ｘ＋１４.５３，Ｒ２ ＝ ０.９９９，计算得出检出限为１２. ３９ ｃｏｐｉｅｓ/ μＬ， 定量限为３３. ９７ｃｏｐｉｅｓ/ μＬ。

Ａ０８、Ｂ０８、Ｃ０８ 的ＤＮＡ 浓度为１０５ ｃｏｐｉｅｓ/ μＬ，Ｄ ０８、Ｅ０８、Ｆ０８的ＤＮＡ浓度为１０４ ｃｏｐｉｅｓ / μＬ，Ｇ０８、Ｈ０８ 的ＤＮＡ 浓度为１０３ ｃｏｐｉｅｓ/ μＬ， Ｂ０９、Ｃ０９、Ｄ０９ 的ＤＮＡ 浓度为１０２ ｃｏｐｉｅｓ/ μＬ， Ｅ０９、Ｆ０９、Ｇ０９ 的ＤＮＡ 浓度为１０１ ｃｏｐｉｅｓ/ μＬ， Ｈ０９、Ｄ１０、Ｅ１０ 的ＤＮＡ 浓度为１００ ｃｏｐｉｅｓ/ μＬ， Ｆ１０、Ｇ１０、Ｈ１０ 的ＤＮＡ 浓度为１０－１ ｃｏｐｉｅｓ/ μＬ。

２.３ 候选标准物质的制备与鉴定

将提取的ｐＵＣ５７－α－ｔｏｘｉｎ 质粒进行双酶切和ＰＣＲ 鉴定，结果均可见大小为１ １４６ ｂｐ 的片段，符合预期（图５Ａ、Ｃ）。 电泳鉴定线性化质粒，仅见１ 条条带且大小正确，证实酶切完全（图５Ｂ）。将质粒交由公司进行测序，结果其序列与大肠产气荚膜梭菌α－ｔｏｘｉｎ 完全一致。 证明产气荚膜梭菌α－毒素基因质粒ＤＮＡ 候选标准物质基因序列正确。

２.４ 临床样品的验证及基质效应评价

对６８ 份临床阳性病料进行检测，结果３８ 份产气荚膜梭菌阳性病料的拷贝数均高于１ ０００（荧光值均高于２ ０００），其他非特异性菌株阳性病料的拷贝数均为零（荧光值均低于２ ０００）。 证明建立的ｄｄＰＣＲ 方法可用于临床样品的检测。测定的结果采用线性回归分析方法进行分析，参考?基质效应与互通性评估指南?[８] 中的方法，计算样本测定值双侧９５％置信区间。 结果表明，标准物质的测定均值在临床样本９５％置信区间内（图６），表明标准物质无明显的基质效应。

２.５ 候选标准物质的检验

对２０ 管候选标准物质进行均匀性检验，采用单因素方差分析法（Ｆ 检验法）对结果进行分析，结果Ｆ<Ｆα，表明样品是均匀的。 经稳定性检验，样品可在－２０ ℃条件下稳定储存１８ 个月，基因含量未发生显著变化；将样品置于４ ℃保存８ ｄ，结果样品的检测值无显著变化，表明标准物质在４ ℃运输条件下可稳定保持。 模拟反复冻融，结果样品冻融３０ 次，基因含量未发生显著变化。

２.６ 定值

联合９ 家实验室应用ｄｄＰＣＲ 方法进行定值。应用ＳＰＳＳ 软件，对定值数据进行正态分布检验，结果显示数据符合正态分布；应用Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ做出正态分布的直方图，拟合正态曲线（图７）。对组内数据可疑值检验，结果各组所有最大值和最小值之差的绝对值｜ｖｉ ｜均小于l（α，ｎ）ｓ，证实组内没有可疑值。 对各组数据进行等精度检验，计算出Ｃ 值为０.１８，实验室取α 为０.０５，数据组数９，重复测定次数９，查科克伦检验临界值Ｃ（α，ｍ，ｎ） 为０.２７；结果Ｃ≤Ｃ（α，ｍ，ｎ） ，表明各组数据为等精度。 对平均值最大组及平均值最小组之间的数据进行ｔ 检验，ｔ 值为２.７４，查ｔ 值表ｔα为２.７８，ｔ<ｔα，证明各组平均值之间无显著差异[７] 。

２.７ 不确定度评定

用ｕＡ，ｒｅｌ表示相对Ａ 类不确定度，经计算ｕＡ，ｒｅｌ为２.１％。 用ｕＢ，ｒｅｌ 表示Ｂ 类相对不确定度，经计算ｕＢ，ｒｅｌ为３.２％。 用ｕｂｂ，ｒｅｌ表示均匀性差异带来的不确定度，经计算为２.３％。 用Ｕｌｔｓ和Ｕｓｔｓ分别表示长期和短期不确定度，经计算分别为６.６０％和３.４２％。将各分量合成得到标准物质的合成相对不确定度ｕＣＲＭ，ｒｅｌ 为８.６７％，扩展相对不确定度ｕＣＲＭ，ｒｅｌ为１７.３４％，扩展不确定度ｕＣＲＭ为０.５９×１０３ｃｏｐｉｅｓ/ μＬ。 综合确定制备的标准物质的定值为（３.４３±０.４３）×１０３ ｃｏｐｉｅｓ/ μＬ。

２.８ 比对与验证

购置中国计量科学研究院制备的猪繁殖与呼吸障碍综合征标准物质，用ｄｄＰＣＲ 方法对其进行测定。 ３ 次的结果分别为９.４１×１０８、９.３８×１０８、９.４２×１０８ ｃｏｐｉｅｓ/ μＬ，经分析，该值符合标准物质说明书上的定值（标准值９.４×１０８ ｃｏｐｉｅｓ/ μＬ，扩展不确定度０.９×１０８ ｃｏｐｉｅｓ/ μＬ）。 证明本研究建立的ｄｄＰＣＲ 方法对标准物质的定值正确。

３ 讨论与结论

产气荚膜梭菌分布广泛，对人类和动物的健康造成严重危害。 该菌可产生多种毒素，其中Ａ型产气荚膜梭菌分泌的α－毒素是动物和人食源性感染的主要毒素型。 研究表明，α－毒素能够突破血脑屏障、侵害延髓、破坏呼吸系统及心脏的传导系统，最终引发动物“猝死症”[１０] 。 产气荚膜梭菌可跟据其产生的４ 种主要毒素（α、β、ε、ι）分为５ 种毒素型（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ）。 其中α－毒素是产气荚膜梭菌分泌的主要致死毒素，是一种多功能磷脂酶，几乎所有产气荚膜梭菌都能产生α－毒素。Ｙｏｎｏｇｉ 等[１１] 建立了用于检测产气荚膜梭菌各种毒素的多重ＰＣＲ 检测方法；ｖａｎ Ａｓｔｅｎ 等[１２] 针对α、β、ε 等毒素建立了多重ＰＣＲ 检测方法；Ｓｈａｎ￣ｎｏｎ 等[１３] 建立了用于检测城市污水中特定病原菌的荧光定量ＰＣＲ 检测方法；Ｈａｎａｂａｒａ 等[１４] 建立了用于检测人类粪便中食源性致病菌的荧光定量ＰＣＲ 检测方法；另有其他众多关于检测产气荚膜梭菌的报道[１５－２２] ，他们使用的靶基因均为α－毒素基因。

ｄｄＰＣＲ 方法是一种对核酸分子进行绝对定量的检测技术，已广泛应用于病原检测领域，尤其适用于对低拷贝、低含量病原早期的精准检测，可有效弥补普通荧光定量ＰＣＲ 方法的不足。ｄｄＰＣＲ 将反應体系分散为上万个微滴，微滴经ＰＣＲ 扩增后，利用微滴检测仪对每个微滴进行检测，最后根据泊松分布原理，直接计算阳性微滴的个数，从而实现直接定量核酸浓度。 本研究建立的产气荚膜梭菌α－毒素基因ｄｄＰＣＲ 方法，具有较好的特异性、灵敏性和重复性，与Ｌｉ[２３－２４] 、Ｃｏｒ￣ｂｉｓｉｅｒ[２５] 、Ｄｕｐａｓ[２６] 等的报道一致。ｄｄＰＣＲ 检测中，ＤＮＡ 浓度过高会超出仪器的检测范围，无法直接用于检测；而ＤＮＡ 浓度过低则会对标准物质的稳定性产生不利影响。 为保证标准物质的稳定性，以更好地应用于临床，本研究制备了浓度相对较低（１０３ ｃｏｐｉｅｓ/ μＬ） 的标准物质。 ｄｄＰＣＲ 为直接定量方法，其对标准物质的定值结果是全国标准物质管理委员会评价其可信度的主要指标。 本研究利用建立的ｄｄＰＣＲ 方法对标准物质进行定值，并获得了国家市场监督管理总局颁发的标准物质证书（ＧＢＷ（Ｅ） ０９１２３７）。该标准物质的研发成功，可促进产气荚膜梭菌诊断试剂的标准化，减少检测误差，确保检验人员的检测能力，规范试剂盒的管理。

相较于其他定值方法，ｄｄＰＣＲ 法对技术人员和试剂等要求更高，但随着技术进步和试剂成本的逐步降低，本研究建立的产气荚膜梭菌α－毒素基因ｄｄＰＣＲ 检测方法，必将具有广阔的应用前景。

参 考 文 献：

[１] Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ Ｂ， Ｋｉｎｚｌｅｒ Ｋ Ｗ. Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ[Ｊ]. Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９９９，９６： ９２３６－９２４１.

[２] 黄瑾，梁涛波，许恒毅. 数字ＰＣＲ 在生物学检测中应用的研究进展[Ｊ]. 生命科学，２０２１，３３（２）：２５５－２６４.

[３] Ｓａｃｈｅｒ Ａ Ｇ， Ｐａｗｅｌｅｔｚ Ｃ， Ｄａｈｌｂｅｒｇ Ｓ Ｅ， ｅｔ ａｌ. Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｖａｌ￣ｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｒａｐｉｄ ｐｌａｓｍａ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＥＧＦＲａｎｄ ＫＲＡＳ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ａｄｖａｎｃｅｄ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ[Ｊ]. ＪＡＭＡ Ｏｎ￣ｃｏｌｏｇｙ， ２０１６， ２（８）： １０１４－１０２２.

[４] ｖａｎ Ｇｉｎｋｅｌ Ｊ Ｈ， Ｈｕｉｂｅｒｓ Ｍ Ｍ Ｈ， ｖａｎ Ｅｓ Ｒ Ｊ Ｊ， ｅｔ ａｌ. Ｄｒｏｐｌｅｔｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒＤＮＡ ｉｎ ｐｌａｓｍａ ｏｆ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ[Ｊ]. ＢＭＣＣａｎｃｅｒ， ２０１７， １７（１）： １－８.

[５] Ｇｒａｕ￣Ｒｏｍａ Ｌ， Ｎａｖａｒｒｏ Ｍ， Ｂｌａｔｔｅｒ Ｓ， ｅｔ ａｌ. Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒ￣ｆｒｉｎｇｅｎｓ￣ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｎｅｃｒｏｔｉｃ ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ￣ｌｉｋｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ｃｏｃｏｎｕｔ ｌｏｒ￣ｉｋｅｅｔｓ （Ｔｒｉｃｈｏｇｌｏｓｓｕｓ ｈａｅｍａｔｏｄｕｓ）[Ｊ]. Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０２１， ５８（２）： ４２３－４２７.

[６] Ｘｕ Ｗ Ｐ， Ｗａｎｇ Ｈ Ｒ， Ｌｉｕ Ｌ Ｘ， ｅｔ ａｌ. Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ａｎｄ ｃｈａｒａｃ￣ｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｈｉｃｋｅｎ ｆａｒｍｓ ｉｎ Ｃｈｉｎａ[Ｊ]. Ａｎａｅｒｏｂｅ， ２０２１， ７２： １０２４６７.

[７] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局. 分析方法检出限和定量限的评估：ＧＢ/ Ｔ ２７４１５—２０１３[Ｓ]. 北京：中国标准出版社，２０１３.

[８] 中华人民共和国卫生部. 基质效应与互通性评估指南：ＷＳ/Ｔ ３５６—２０１１[Ｓ]. 北京：中国标准出版社，２０１２.

[９] 张喜悦，张铭洋，赵格，等. 弯曲杆菌１６Ｓ ｒＲＮＡ 基因质粒ＤＮＡ 标准物质的研制[Ｊ]. 中国动物检疫，２０２３，４０（７）：１０３－１０９.

[１０] 王苗利，蔡玉梅，柴同杰，等. 感染Ａ 型产气荚膜梭菌小鼠体内α 毒素的分布及定位[Ｊ]. 动物医学进展，２０１１，３２（１０）：１９－２３.

[１１] Ｙｏｎｏｇｉ Ｓ， Ｋａｎｋｉ Ｍ， Ｏｈｎｉｓｈｉ Ｔ， ｅｔ ａｌ. Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ａｐｐｌｉ￣ｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ￣ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｇｅｎｅｓ ｃｐｅ ａｎｄ ｂｅｃＡＢ [ Ｊ].Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ２０１６， １２７： １７２－１７５.

[１２] ｖａｎ Ａｓｔｅｎ Ａ Ｊ Ａ Ｍ， ｖａｎ ｄｅｒ Ｗｉｅｌ Ｃ Ｗ， Ｎｉｋｏｌａｏｕ Ｇ， ｅｔ ａｌ. Ａｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ｆｏｒ ｔｏｘｉｎ ｔｙｐｉｎｇ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ ｉｓｏ￣ｌａｔｅｓ[Ｊ]. Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ （Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）， ２００９， １３６（３/４）： ４１１－４１２.v[１３] Ｓｈａｎｎｏｎ Ｋ Ｅ， Ｌｅｅ Ｄ Ｙ， Ｔｒｅｖｏｒｓ Ｊ Ｔ， ｅｔ ａｌ. Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｂａｃｔｅｒｉａｌｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｄｕｒｉｎｇ ｍｕｎｉｃｉｐａｌ ｗａｓｔｅｗａｔｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ[Ｊ]. Ｓｃｉｅｎｃｅｏｆ Ｔｈｅ Ｔｏｔａｌ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，２００７， ３８２（１）： １２１－１２９.

[１４] Ｈａｎａｂａｒａ Ｙ， Ｕｅｄａ Ｙ. Ａ Ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｓｉｍｐｌｅ ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ ａｓｓａｙｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｆｏｏｄｂｏｒｎｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｆｅｃｅｓ[Ｊ].Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ， ２０１６， ６９（６）： ４７１－４７６.

[１５] 任宏榮，李苗云，朱瑶迪，等. 产气荚膜梭菌在食品中的危害及其控制研究进展[Ｊ]. 食品科学，２０２１，４２（７）：３５２－３５９.

[１６] 孙雨，王晓英，董浩，等. 产气荚膜梭菌外毒素基因与相关疫苗的研究进展[Ｊ]. 中国草食动物科学，２０１６，３６（２）：５８－６２.

[１７] 刘立兵，李睿文，陈志敏，等. 产气荚膜梭菌实时荧光ＰＣＲ和实时荧光ＲＰＡ 检测方法的建立和比较[Ｊ]. 食品科学，２０２０，４１（４）：２６８－２７２.

[１８] 石玉玲，曾兰兰，陈丽丹，等. 产气荚膜梭菌实时荧光ＰＣＲ方法的建立[Ｊ]. 生物技术通讯，２０１０，２１（３）：３８９－３９２.

[１９] Ｂｒｙｎｅｓｔａｄ Ｓ， Ｇｒａｎｕｍ Ｐ Ｅ. Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ ａｎｄ ｆｏｏｄ￣ｂｏｒｎｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ[Ｊ]. Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ￣ｇｙ， ２００２， ７４（３）： １９５－２０２.

[２０] Ｍａｉｋａｎｏｖ Ｂ， Ｍｕｓｔａｆｉｎａ Ｒ， Ａｕｔｅｌｅｙｅｖａ Ｌ， ｅｔ ａｌ. Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ａｎｄ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ ｉｎ Ｋａｚａｋｈｈｏｎｅｙ ｓａｍｐｌｅｓ[Ｊ]. Ｔｏｘｉｎｓ， ２０１９， １１（８）： ４７２.

[２１] Ｂｒａｄｙ Ｊ， Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ￣Ｄｏｒｉａ Ｊ Ｄ， Ｂｅｎｎｅｔｔ Ｃ， ｅｔ ａｌ. Ｔｏｘｉｎｏｔｙｐｉｎｇｏｆ ｎｅｃｒｏｔｉｃ ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ￣ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ａｎｄ ｃｏｍｍｅｎｓａｌ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ Ｃｌｏｓ￣ｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ ｆｒｏｍ ｃｈｉｃｋｅｎｓ ｆｅｄ ｏｒｇａｎｉｃ ｄｉｅｔｓ[Ｊ]. ＡｖｉａｎＰａｔｈｏｌｏｇｙ， ２０１０， ３９（６）： ４７５－４８１.

[２２] 門佩璇，肖宇锋，张玢. 基于计量学方法分析数字ＰＣＲ 技术的临床应用现状与技术热点[Ｊ]. 生物技术进展，２０２２，１２（４）：６０６－６１３.

[２３] Ｌｉ Ｊ， Ｌｉ Ｌ， Ｚｈａｎｇ Ｌ， ｅｔ ａｌ. Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｍａｔｅｒｉａｌ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅ￣ｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｒｉｃｅ ＫＭＤ[Ｊ]. Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ａｎｄ ＢｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２０２０， ４１２（２５）： ７００７－７０１６.

[２４] Ｌｉ Ｊ， Ｚｈａｉ Ｓ Ｓ， Ｇａｏ Ｈ Ｆ， ｅｔ ａｌ. Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆａ ｄｕｐｌｅｘ ｄｒｏｐｌｅｔ ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＧＭｒｉｃｅ Ｋｅｍｉｎｇｄａｏ[Ｊ]. Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２０２１，４１３（１６）： ４３４１－４３５１.

[２５] Ｃｏｒｂｉｓｉｅｒ Ｐ，Ｐｉｎｈｅｉｒｏ Ｌ，Ｍａｚｏｕａ Ｓ，ｅｔ ａｌ. ＤＮＡ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ ｄｉｇｉｔａｌ ａｎｄ ｄｒｏｐｌｅｔ ｄｉｇｉｔａｌ ｑｕａｎｔｉｔａ￣ｔｉｖｅ ＰＣＲ ｕｓｉｎｇ ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｍａｔｅｒｉａｌｓ[Ｊ]. Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ａｎｄＢｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１５，４０７（７）： １８３１－１８４０.

[２６] Ｄｕｐａｓ Ｅ，Ｌｅｇｅｎｄｒｅ Ｂ，Ｏｌｉｖｉｅｒ Ｖ，ｅｔ ａｌ. Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ ａｎｄ ｄｒｏｐｌｅｔ ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｘｙｌｅｌｌａｆａｓｔｉｄｉｏｓａ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ[ Ｊ]. Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１９， １６２： ８６－９５.