创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ 质粒定性标准样品的研制及其在水产品检测中的应用

袁玮 陈蕾蕾 杨金玉 周庆新 裘纪莹 赵双枝 付恩君 赵国琰 陈相艳

摘要：针对我国缺乏适用于创伤弧菌检测的质粒标准样品的现状，本研究开展了创伤弧菌鉴定即用型定性质粒标准样品的研制和应用工作。 首先构建了创伤弧菌毒力基因ｖｖｈＡ 的重组质粒，经测序验证后制备成质粒标准样品冻干粉，然后对其进行ＰＣＲ 定性检测及紫外分光光度计法定量分析。 均匀性检验结果表明，样品间无显著差异，均匀性良好，符合预期目标；短期稳定性检验结果表明，样品能在４ ℃、３７ ℃条件下稳定保存１４ 天；长期稳定性检验结果表明，样品能在－２０ ℃条件下稳定保存至少１２ 个月。 研究结果表明，创伤弧菌质粒定性标准样品的均匀性和稳定性均符合国家定性标准样品的要求，为创伤弧菌的快速、高通量的定性鉴定分析提供了可靠的参考物质。 将标准样品应用于鱼类、贝类等１０ 份海鲜类食品样品的检测中，经传统培养法验证，检测结果准确无误。 本研究所研制的创伤弧菌质粒定性标准样品具有较好的商业应用潜力，为其在食品检测领域的推广应用奠定了重要基础。

关键词：创伤弧菌；质粒定性标准样品；水产品；检测

中图分类号：Ｓ８５２.６１文献标识号：Ａ文章编号：１００１－４９４２（２０２４）０１－０１４７－０９

创伤弧菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）是一种革兰氏阴性菌，主要特性为嗜盐、喜温，自然分布于世界各地沿海和河口水域[１－２] ，是一种人畜共患病原菌，容易感染鱼、虾、牡蛎、蛤、螃蟹等海产品，人类通过生食或食用未完全煮熟的海产品、破损皮肤直接接触被其污染的海水或海产品而患病[３] 。 创伤弧菌与霍乱弧菌、副溶血弧菌并称为人类三大致病弧菌[４] ，弧菌感染病例具有明显的季节性，大多数发生在夏季和初秋气温较高的时期[５] 。随着全球气候变暖、海洋温度升高等自然条件的变化，创伤弧菌的感染率也逐年增加。 在全世界范围内创伤弧菌感染的死亡率高达６０％，在美国约为３３％，使其成为严重的公共卫生和食品安全问题[６－７] 。 创伤弧菌感染的主要症状包括肠胃炎、原发创伤性感染、败血症和坏死性筋膜炎等，免疫力低下或患有糖尿病、肝脏疾病等慢性基础病的患者属于易感人群[８] 。 创伤弧菌伤口感染通常以肿胀、红斑和剧烈疼痛为特征，潜伏期短，发病迅速，病变经常演变为可坏死的囊泡或充满液体的大泡，最终引起多脏器衰竭[９] 。

创伤弧菌菌体产生的创伤弧菌外毒素通过特定的毒力机制引发疾病。 创伤弧菌毒力因子主要包括溶细胞素、铁载体、金属蛋白酶、荚膜多糖等[１０] ，由ｖｖｈＡ 基因编码的创伤弧菌溶细胞素是唯一分泌到细胞外的外毒素，具有创伤弧菌种属特异性，可作为鉴定创伤弧菌的指标[１１] 。 当前，对创伤弧菌进行定量检测主要通过平板计数、ＭＰＮ 法等传统培养法，这些方法需要进行过夜培养、选择性平板分离、生化鉴定、血清学检测等繁琐的试验步骤，不仅耗时费力，同时样本中杂菌的过量繁殖也会对鉴别结果产生影响。 另外，由于水产品中的创伤弧菌通常处于“活的且不可培养”的状态[１２－１３] ，传统的培养方法很难对该部分创伤弧菌进行有效鉴定，严重降低了检测结果的准确度。 作为最危险的食源性细菌之一，创伤弧菌造成了９５％的海鲜相关死亡，已成为一个主要的食品安全问题[１４] 。 随着食品供应链的全球化，创伤弧菌的定期监测变得更加重要。

为了满足当下快速、高通量检测的需求，分子生物学方法在食品微生物的检测中得到了越来越广泛的应用，但相关的参考物质相对匮乏。 食源性微生物检测即用型标准样品的研制，有助于解决目前国内食品微生物检测中存在的参考物质不足的难题，使具有自主知识产权的标准样品在相关领域得到更好的推广和应用，从而摆脱对国外标准样品的依赖。 因此，建立创伤弧菌鉴定检测即用型质粒定性标准样品用于其快速、高通量鉴定，对提高水产品的质量安全、保证人类健康具有重要意义。

１ 材料与方法

１.１ 试验材料

１.１.１ 菌株来源 创伤弧菌（ＣＩＣＣ ２１６１５）来源于中国工业微生物保藏中心。

１.１.２ 主要试剂 琼脂糖购自上海贝晶生物技术有限公司；ＰＮＣＣ 增菌液基础培养基、ＰＮＣＣ 添加剂、ｍＣＰＣ 琼脂基础培养基、多粘菌素Ｅ、多粘菌素Ｂ 购自北京陆桥技术股份有限公司；核酸染料ＧｅｌＳｔａｉｎ、Ｔｒａｎｓ １５０００ ｍａｒｋｅｒ、Ｔｒａｎｓ ２０００ ｍａｒｋ￣ｅｒ、质粒大提试剂盒购自北京全式金生物技术股份有限公司；５０×ＴＡＥ 缓冲溶液购自生工生物工程（上海）股份有限公司；２×Ｔａｑ ＰＣＲ Ｍｉｘ、琼脂糖凝胶ＤＮＡ 回收试剂盒、ｐＬＢ 零背景快速克隆试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。

１.１.３ 仪器和设备 ＺＨＷＹ－２００Ｈ 恒温培养振荡器购自上海智城分析仪器制造有限公司；ＳＷＣＪ－２Ｄ 双人净化工作台购自苏州净化设备有限公司；Ｃ１０００ Ｔｏｕｃｈ ＰＣＲ 仪、ＮａｎｏＤｒｏｐＴＭ２０００ 超微量分光光度计购自赛默飞世尔科技公司；ＪＹ６００Ｃ水平电泳仪、ＪＹ０４Ｓ－３Ｃ 凝胶成像系统购于北京君意东方电泳设备有限公司。

１.２ 试验方法

１.２.１ 重组质粒的获取与验证 创伤弧菌ｖｖｈＡ基因片段由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，获得重组质粒ＰＵＣ－ＳＰ－ｖｖｈＡ，并保存于大腸埃希氏菌Ｔｏｐ１０ 菌株中。 依据ＧＢ ４７８９.４４—２０２０?食品安全国家标准食品微生物学检验创伤弧菌检验?[１５] 中创伤弧菌ＰＣＲ 检测的引物序列，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成引物（表１）。 以重组质粒为模板，利用创伤弧菌鉴定引物，对目的基因进行ＰＣＲ 扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，使用琼脂糖凝胶ＤＮＡ 回收试剂盒对ＰＣＲ 产物进行胶回收，使用ｐＬＢ 零背景快速克隆试剂盒将ＰＣＲ 纯化产物连接至ｐＬＢｓｉｍｐｌｅＶｅｃｔｏｒ 上，并转化大肠杆菌ＤＨ５α 感受态细胞，置于３７ ℃培养箱培养１２ ｈ。 从平板上挑取单菌落，经ＰＣＲ 反应鉴定为阳性的克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序鉴定，测序结果与预期一致的，即为验证正确的重组质粒。将携带正确重组质粒的大肠埃希氏菌于－８０ ℃超低温冰箱中甘油管保存。

１.２.２ 重组质粒的提取 将携带重组质粒的大肠埃希氏菌甘油管解冻，接入４ ｍＬ ＬＢ 液体培养基中，放入２００ ｒ/ ｍｉｎ 的振荡摇床中３７ ℃培养１２ｈ，取２ ｍＬ 种子液转接于２００ ｍＬ 的ＬＢ 液体培养基中扩大培养，获取大量携带重组质粒大肠埃希氏菌的培养液，利用细菌质粒大提试剂盒提取质粒。 琼脂糖凝胶电泳分析质粒完整性，ＰＣＲ 验证目的基因，紫外分光光度计检测质粒的浓度和纯度。

１.２.３ 重组质粒的含量检测 取重组质粒样品１μＬ，于ＮａｎｏＤｒｏｐＴＭ２０００ 超微量分光光度计中检测浓度，每管检测两次。

１.２.４ 重组质粒的分装 将大提的质粒样品混合至１ 管中，采用紫外分光光度计测定浓度，然后用无菌去离子水稀释至２０ ｎｇ/ μＬ，每管１００ μＬ分装至螺口冻存管中，贴上标签。

１.２.５ 重组质粒的冷冻干燥 由于质粒样品较为稳定，分装后可直接冻干。 在－２５ ℃、真空度为５０ Ｐａ 条件下冻干２０ ｈ。

１.２.６ 质粒定性标准样品的均匀性分析 按照随机抽号系统抽取的号码，抽取质粒定性标准样品１２ 管，用１００ μＬ 无菌水溶解质粒冻干粉。 取０.５μＬ 溶解的质粒样品作为ＰＣＲ 模板，按照１.２.１ 方法进行基因定性檢测；取质粒样品２ μＬ，按照１.２.１方法琼脂糖凝胶电泳分析质粒样品的完整性；取质粒样品１ μＬ，采用紫外分光光度计法进行复溶质粒样品的定量试验，检测样品的浓度，每管测两次，核酸含量＝核酸浓度×水化体积，核酸含量结果统计分析采用方差分析法。

１.２.７ 质粒定性标准样品的稳定性分析 稳定性检验方法同均匀性检验，核酸含量结果统计分析采用单因素方差分析法。

短期稳定性检验：采取两种短期稳定性试验。第一种模拟冰袋运输：在４ ℃条件下的短期储存稳定性试验，随机取样２１ 管置于４ ℃保温箱，分别在第１、３、５、７、９、１１、１４ 天每天检测３ 管，每管２ 个重复；第二种模拟高温运输：在３７ ℃ 条件下稳定性试验，随机取样２１ 管置于３７ ℃保温箱，分别在第１、３、５、７、９、１１、１４ 天时每天检测３ 管，每管２ 个重复。

长期稳定性检验：质粒样品经冷冻干燥后，需要在－２０ ℃条件下长期冷冻保存。 为了测定质粒样品长期保存时间及其稳定性，每次检测时，从冷冻样品中随机取出３ 管样品，每管重复２ 次。 抽样时间点遵循先密后疏的原则，分别在第１、２、４、６、８、１０、１２ 个月共７ 个时间点抽样检测。

１.２.８ 创伤弧菌质粒定性标准样品在食品检测中的应用 食品样本的前处理：将购买的食品样本按照ＧＢ ４７８９.４４—２０２０ 要求处理，在无菌条件下，称取鲫鱼、偏口鱼、银鲳鱼、鲤鱼、鲅鱼、黄花鱼６ 种鱼类样品的表面组织、肠和腮各２５ ｇ，花蛤、海蛎子和生蚝３ 种贝类样品内容物各２５ ｇ，明虾的头足部组织２５ ｇ，分别放入含２２５ ｍＬ ＰＮＣＣ 增菌液的无菌均质袋，用拍打式无菌均质器拍打２ｍｉｎ 制成样品匀液；将均质袋放入培养箱３７ ℃培养１８ ｈ 获得增菌液，取距液面１ ｃｍ 深处菌液１ｍＬ 放入离心管中，９ ０００ ｒ/ ｍｉｎ 离心３ ｍｉｎ，去上清；用１ ｍＬ ＰＢＳ 磷酸盐缓冲液悬浮清洗后９ ０００ｒ/ ｍｉｎ 离心３ ｍｉｎ，去上清，重复２ 次；加入１ ｍＬ 无菌去离子水，煮沸１０ ｍｉｎ，１２ ０００ ｒ/ ｍｉｎ 离心５ｍｉｎ，吸取上清液。

ＰＣＲ 分析：将上清液用作ＰＣＲ 反应的ＤＮＡ模板；随机抽取１ 管创伤弧菌重组质粒定性标准样品，加入１００ μＬ 无菌去离子水溶解，作为阳性对照；将大肠埃希氏菌ＣＩＣＣ １０００３ 基因组ＤＮＡ 冻干粉用３００ μＬ 无菌水溶解（终浓度为２０ ｎｇ/ μＬ）后作为阴性对照；无菌去离子水为空白对照，按照

１.２.１的方法进行ＰＣＲ 分析。

创伤弧菌的分离验证：取检测为阳性的食品样本的增菌液，用接种环将其划线接种于ＣＣ 平板和ｍＣＰＣ 平板，３７ ℃ 培养１８ ｈ，验证菌落形态是否符合创伤弧菌菌落形态特征，即圆形、扁平，

光照下透明但中心不透明的黄色或橘黄色菌落，直径１～２ ｍｍ。

创伤弧菌的生化鉴定：按照ＧＢ ４７８９.４４—２０２０ 进行创伤弧菌的培养和生化特性鉴定。

１.３ 数据统计与分析

使用ＳＰＳＳ ２６.０ 软件的ＡＮＯＶＡ 法进行单因素方差分析，统计各处理组之间的差异性，数据用“平均值±标准误”表示，Ｐ<０.０５ 表示差异显著。

２ 结果与分析

２.１ 创伤弧菌重组质粒的验证

以创伤弧菌重组质粒为模板，对其进行目的基因ＰＣＲ 扩增验证，以大肠埃希氏菌ＣＩＣＣ １０００３为阴性对照，无菌去离子水为空白对照。 琼脂糖凝胶电泳分析ＰＣＲ 扩增结果（图１Ａ）显示，创伤弧菌重组质粒ｖｖｈＡ 基因为阳性，条带清晰，片段大小为５１９ ｂｐ，符合目的条带大小，说明成功构建了创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ 重组质粒，质粒图谱如图１Ｂ 所示。

２.２ 创伤弧菌重组质粒的浓度及纯度分析

取重组质粒１ μＬ，利用ＮａｎｏＤｒｏｐＴＭ２０００ 测定其浓度和纯度， 结果如表２ 所示， Ａ２６０/２８０、Ａ２６０/２３０ 均超过１.８，说明所提取的质粒纯度高，无蛋白质和有机物污染；对其携带的基因进行ＰＣＲ 扩增，琼脂糖凝胶电泳分析结果（图２Ａ）显示，目的基因ｖｖｈＡ 条带单一且片段大小符合预期，质粒完整性分析（图２Ｂ）显示质粒条带完整，说明所制备的质粒符合预期。

将４ 管大提的创伤弧菌重组质粒样品混合至１ 管中，采用紫外分光光度计测定浓度，然后用无菌去离子水稀释至２０ ｎｇ/ μＬ，取１００ μＬ 分装至２ｍＬ 螺口冻存管中，所有质粒溶液分装４５０ 管后，置于真空冷冻干燥机中按照冷冻程序真空冷冻干燥，获得白色粉末状的冻干质粒样品，设计创伤弧菌重组质粒定性标准样品标签纸，打印并贴在管外（图３）。 质粒定性标准样品置于－２０ ℃冰箱冻存。

２.３ 创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ 质粒定性标准样品的均匀性分析

从４５０ 管质粒标准样品中随机抽取１２ 管进行ＰＣＲ 定性试验，结果如图４Ａ 所示，各管ＰＣＲ扩增目的基因均为阳性，条带单一且清晰，图４Ｂ显示质粒完整无降解。 使用ＮａｎｏＤｒｏｐＴＭ ２０００ 超微量分光光度计进行质粒标准样品的浓度、纯度分析，对所测数据进行单因素方差分析，结果如表３ 所示，在９５％的置信概率下，Ｆ 值小于Ｆ 临界值，各管间质粒含量无显著性差异，表明质粒定性标准样品均匀性良好。

２.４ 创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ 质粒定性标准样品的稳定性分析

温度是运输过程中影响质粒定性标准样品质量的主要因素，因此设计不同温度模拟质粒样品运输条件，以质粒标准样品目的基因阳性检出、质粒完整性及核酸含量变化确定其短期稳定性（运输稳定性）。 创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ 质粒定性标准样品分别在４ ℃和３７ ℃条件下保存１４ ｄ，琼脂糖凝胶电泳分析结果（图５、图６）显示第１ 天和第１４天目的基因均为阳性，电泳条带单一，符合预期条带大小，质粒无降解；质粒含量统计学分析结果如图７ 所示，各时间点间无显著性差异，表明质粒含量无明显变化，说明质粒定性标准样品在上述条件下是稳定的。 因此创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ 质粒定性标准样品可与冰袋（４ ℃）一起运输，也可在温度较高（３７ ℃）且无降温装置条件下运输。

为了分析创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ 质粒定性标准样品的长期稳定性，在第１、２、４、６、８、１０、１２ 个月随机抽取３ 管样品进行定性和定量分析。创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ 质粒定性标准样品在－２０ ℃条件下保存１２ 个月，琼脂糖凝胶电泳分析结果显示第１ 个月和第１２ 个月目的基因均为阳性，电泳条带单一，符合预期条带大小（图８Ａ、Ｂ），质粒无降解（图８Ｃ、Ｄ）。

质粒含量统计学分析结果如图９ 所示，各时间点间无显著性差异，表明质粒定性标准样品在－２０ ℃ 条件下稳定，说明创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ 质粒定性标准样品能在－２０ ℃条件下稳定保存至少１２ 个月。

２.５ 创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ 质粒定性标准样品在水产品检测中的应用

为了验证创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ 质粒定性标准样品在水产品检测中的应用效果，将其作为阳性对照，参照ＧＢ ４７８９.４４—２０２０ 的方法，利用ＰＣＲ 对１０ 种水产品中的创伤弧菌基因ｖｖｈＡ 进行检测，每种样品取样７ 次，每个样品７ 个重复。结果如表４ 所示，在１０ 种水产品样本中检测出１例ｖｖｈＡ 基因阳性。 将阳性样本的增菌液划线至创伤弧菌鉴定平板ＣＣ 平板和ｍＣＰＣ 平板中，每种平板重复划线３ 次，３７ ℃ 培养１８ ｈ，平板菌落为黄色、圆形且扁平（图１０）。 挑取菌落按照ＧＢ４７８９.４４—２０２０ 要求进行生化鉴定（图１１、表５），验证此阳性样本感染创伤弧菌。

３ 讨论与结论

本研究构建了创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ 的重组质粒ＰＵＣ－ＳＰ－ｖｖｈＡ，经测序验证后，将质粒样品真空冷冻干燥制成创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品冻干粉。 对其进行均匀性和稳定性分析，检测结果均为阳性且符合目的基因片段的大小，质粒样品无降解；均匀性分析定量检测结果表明，质粒定性标准样品无管间差异，均匀性良好；稳定性分析定量检测结果表明，质粒定性标准样品在低温（４ ℃）或高温（３７ ℃）下可稳定保存１４ 天；在－２０ ℃下長期存储１２ 个月，亦未观测到不稳定性。 将所研制的创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ 质粒定性标准样品应用于１０ 种海鲜产品的检测，检出１ 份阳性样本，经传统培养法和生化鉴定验证，证实阳性样本确为创伤弧菌污染，表明质粒定性标准样品能够满足水产品中创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ 的快速、精确检测。 该研究填补了我国创伤弧菌鉴定即用型质粒定性标准样品的空白，为创伤弧菌质粒定性标准样品在食品检测领域的应用研究打下了良好的基础。

参 考 文 献：

[１] Ｙｕｎ Ｎ Ｒ， Ｋｉｍ Ｄ Ｍ. Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ： ａ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔｔｈｒｅａｔ ｔｏ ｐｕｂｌｉｃ ｈｅａｌｔｈ[Ｊ]. Ｋｏｒｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉ￣ｃｉｎｅ， ２０１８， ３３（６）： １０７０－１０７８.

[２] Ｈｅｒｎáｎｄｅ￣Ｃａｂａｎｙｅｒｏ Ｃ， Ａｍａｒｏ Ｃ. Ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ ａｎｄ ｌｉｆｅ ｃｙｃｌｅ ｏｆｔｈｅ ｚｏｏｎｏｔｉｃ ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ [ Ｊ]. ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ２０２０， ２２（１０）： ４１３３－４１４８.

[３] 彭钟琴，黄璐. 水产品中创伤弧菌检测方法的研究进展[Ｊ].食品安全导刊，２０２１（３６）：１９０－１９２.

[４] Ｗａｎｇ Ｍ Ｙ， Ｈｕ Ｃ Ｊ. Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｆａｃｔｏｒｓ ｏｆ Ｖｉｂ￣ｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ： ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｄｖａｎｃｅｓ[Ｊ]. Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏ￣ｅｃｏｌｏｇｙ， ２０１７， ２９（１２）： １４７０－１４７３.

[５] Ｉｗａｍｏｔｏ Ｍ，Ａｙｅｒｓ Ｔ，Ｍａｈｏｎ Ｂ Ｅ，ｅｔ ａｌ. Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｓｅａ￣ｆｏｏｄ￣ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ[Ｊ]. Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉ￣ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，２０１０，２３（２）： ３９９－４１１.

[６] Ｊｏｎｅｓ Ｍ Ｋ，Ｏｌｉｖｅｒ Ｊ Ｄ. Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ： ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｐａｔｈｏｇｅｎ￣ｅｓｉｓ[Ｊ]. Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ， ２００９， ７７（５）： １７２３－１７３３.

[７] Ｈｅｎｇ Ｓ Ｐ， Ｌｅｔｃｈｕｍａｎａｎ Ｖ， Ｄｅｎｇ Ｃ Ｙ， ｅｔ ａｌ. Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ：ａｎ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｂｕｒｄｅｎ[Ｊ]. Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉ￣ｏｌｏｇｙ， ２０１７， ８： ９９７.

[８] Ｈｏｒｓｅｍａｎ Ｍ Ａ， Ｓｕｒａｎｉ Ｓ. Ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｖｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ：ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｃａｕｓｅ ｏｆ ｓｅｖｅｒｅ ｓｅｐｓｉｓ ａｎｄ ｓｋｉｎ ａｎｄｓｏｆｔ￣ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ[Ｊ]. Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓ￣ｅａｓｅｓ， ２０１１， １５（３）： ｅ１５７－ｅ１６６.

[９] Ｂａｋｅｒ￣Ａｕｓｔｉｎ Ｃ， Ｔｒｉｎａｎｅｓ Ｊ， Ｇｏｎｚａｌｅｚ￣Ｅｓｃａｌｏｎａ Ｎ， ｅｔ ａｌ. Ｎｏｎ￣ｃｈｏｌｅｒａ ｖｉｂｒｉｏｓ： ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｂａｒｏｍｅｔｅｒ ｏｆ ｃｌｉｍａｔｅ ｃｈａｎｇｅ[Ｊ].Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ２０１７， ２５（１）： ７６－８４.

[１０] Ｌｉ Ｇ， Ｗａｎｇ Ｍ Ｙ. Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆＶｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｆａｃｔｏｒｓａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ ｉｎ ｉｔｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ￣ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｅｐｓｉｓ[Ｊ]. Ｆｏｌｉａ Ｍｉｃｒｏ￣ｂｉｏｌｏｇｉｃａ， ２０２０， ６５（２）： ２６５－２７４.

[１１] Ｇａｖｉｎ Ｈ Ｅ， Ｂｅｕｂｉｅｒ Ｎ Ｔ， Ｓａｔｃｈｅｌｌ Ｋ Ｊ. Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｄｏｍａｉｎ ｒｅ￣ｇｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ ＭＡＲＴＸ ｔｏｘｉｎ ｃｏｎｆｅｒｓ ｂｉｐｈａｓｉｃ ｅｐｉ￣ｔｈｅｌｉａｌ ｂａｒｒｉｅｒ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｓｐｒｅａｄｆｒｏｍ ｔｈｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ [ Ｊ]. ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ， ２０１７， １３ （ １）：ｅ１００６１１９.

[１２] Ｒａｏ Ｎ Ｖ， Ｓｈａｓｈｉｄｈａｒ Ｒ， Ｂａｎｄｅｋａｒ Ｊ Ｒ. Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ， ｒｅｓｕｓｃｉｔａ￣ｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙ￣ｓｅｓ ｏｆ ｖｉａｂｌｅ ｂｕｔ ｎｏｎｃｕｌｔｕｒａｂｌｅ Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ ｉｎ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｓｅａｗａｔｅｒ[Ｊ]. Ｗｏｒｌｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１４， ３０（８）： ２２０５－２２１２.

[１３] 包秋華，刘倩宇. 基于Ｗｅｂ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ 细菌活的非可培养状态研究文献的可视化分析[Ｊ]. 食品科学，２０２３，４４（５）：２４８－２５６.

[１４] Ｚｈａｎｇ Ｘ， Ｇｕｏ Ｂ， Ｙａｎｇ Ｌ Ｈ， ｅｔ ａｌ. ＣＲＩＳＰＲ/ Ｃａｓ１２ａ ｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｓｅｎｓｉ￣ｔｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ ｉｎ ｏｎｅ ｔｕｂｅ[Ｊ]. Ａｃｔａ Ｂｉｏ￣ｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ， ２０２３， ５５（２）： ３２２.

[１５] 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会. 食品安全国家标准：食品微生物学检验创伤弧菌检验：ＧＢ ４７８９.４４—２０２０[Ｓ]. 北京：中国标准出版社，２０２０.