ＬＥＣ１等转录因子基因在花生小种子突变体种子发育过程中的表达分析

2024-04-01朱秀瑾郭凤丹夏晗赵传志侯蕾

山东农业科学 2024年1期

朱秀瑾郭凤丹夏晗赵传志侯蕾

摘要：花生突变体ｓｓｍ１与其对照亲本鲁花１１号（ＬＨ１１）相比，种子皱缩变小，百仁重、单株生产力和含油量显著降低。为了探究导致该突变体种子变小且含油量降低的原因，本试验研究了种子发育关键转录因子基因ＬＣＥ１等在突变体ｓｓｍ１及其对照ＬＨ１１合子受精及种子发育不同阶段的表达情况。结果表明，ＡｈＬＥＣ１在花生未受精子房（ＤＢＰ０）时期表达量较低，且在ｓｓｍ１和对照ＬＨ１１中无明显差异，在受精后的子房（ＤＢＰ１）和入土１０ｄ（ＤＡＰ１０）和２０ｄ（ＤＡＰ２０）种子中表达量上调，并且在ＬＨ１１中的表达量极显著高于突变体ｓｓｍ１、转录因子基因ＡｈＦＵＳ３、ＡｈＡＢＩ３、ＡｈＡＧＬ１５和ＡｈＷＲＩ１在ｓｓｍ１中表达均有不同程度下调。其中，与脂肪酸合成和糖酵解关系密切的ＡｈＷＲＩ１基因在ｓｓｍ１中的表达量显著下调。因此推测，ｓｓｍ１中ＡｈＬＥＣ１基因的表达量显著下调，影响ＡｈＦＵＳ３、ＡｈＡＢＩ３和ＡｈＷＲＩ１等基因的表达，进而导致ｓｓｍ１种子胚胎发育和油脂积累的异常。

关键词：花生、小种子突变体ｓｓｍ１、转录因子基因ＬＥＣ１、基因表达、种子发育、油脂积累

中图分类号：Ｓ５６５.２、Ｑ７８６文献标识号：Ａ文章编号：１００１－４９４２（２０２４）０１－００１０－０７

油脂是油料作物种子主要的贮藏物质，为种子萌发和幼苗生长提供能量。花生（Ａｒａｃｈｉｓｈｙ￣ｐｏｇａｅａＬ.）是我国重要的油料作物之一，我国花生生产量和消费量均居世界第一。我国食用油大量依赖进口，提高花生油产量是解决油料短缺的有效途径[１] ，提高籽仁含油量和产量是花生育种的重要工作。研究发现，多种转录因子对种子中油脂积累具有重要的调控作用。例如，ＬＥＡＦＹＣＯＴ￣ＹＬＥＤＯＮ１（ＬＥＣ１）、ＬＥＣ２、ＡＢＳＣＩＳＩＣＡＣＩＤＩＮＳＥＮ￣ＳＩＴＩＶＥ３（ＡＢＩ３）、ＦＵＳＣＡ３（ＦＵＳ３）、ＷＲＩＮＫＬＥＤ１（ＷＲＩ１）和ＡＧＡＭＯＵＳ￣Ｌｉｋｅ１５（ＡＧＬ１５）等转录因子在调控胚胎发育、脂肪酸合成和糖酵解途径等方面都起着重要作用[２－１４] 。ＬＥＣ１被认为是种子发育的关键调控因子，属于核因子Ｙ（ｎｕｃｌｅａｒｆａｃ￣ｔｏｒ－Ｙ，ＮＦ－Ｙ）转录因子家族，编码ＨＡＰ３复合体的一个亚基，通过与ＣＣＡＡＴ顺式作用元件结合调控基因的表达[３] 。在胚胎发育早期，ＬＥＣ１对维持胚柄细胞以及子叶的特性具有重要意义，而在胚胎发育后期，ＬＥＣ１在种子积累储存脂肪和蛋白质等大分子物质以及种子获得抗脱水能力过程发挥重要作用[４－１３] 。在油菜种子中过量表达Ｂｎ￣ＬＥＣ１基因可使籽粒中的含油量提高２％～２０％，脂肪酸生物合成、蔗糖合成和運输、糖酵解等途径相关基因表达上调，这些生物学途径所需碳通量增加[１５] 。在拟南芥幼苗、种子以及大豆种子中，利用芯片分析ＬＥＣ１基因的异位表达和缺失突变体，结果表明，ＡＢＩ３、ＦＵＳ和ＬＥＣ２都受到ＬＥＣ１的调控[１５] 。ＷＲＩ１在拟南芥种子的油脂积累过程中发挥着极其重要的作用，拟南芥ｗｒｉ１突变体中糖酵解和脂肪酸合成相关基因的表达呈下降趋势[１６] ，种子含油量显著降低[１７] 。研究发现，ＷＲＩ１控制着多个糖酵解途径关键酶的基因以及参与脂肪酸合成的基因的表达，包括ＰＫＰ２、乙酰辅酶Ａ羧化酶（ＡＣＣａｓｅ）、蔗糖合成酶（ＳｕｃｒｏｓｅＳｙｎｔｈａｓｅ２，ＳＵＳ２）等，而ＷＲＩ１的表达受到ＬＥＣ１和ＬＥＣ２的调控，因此，ＬＥＣ是调节脂肪酸合成代谢的关键基因[１６，１８] 。ＡＧＬ１５编码一种ＭＡＤＳ结构域的转录因子，在种子发育过程中调节ＬＥＣ２、ＡＢＩ３和ＦＵＳ３等基因的表达[１９] 。

油料作物种子的正常生长发育与种子中油脂的积累密切相关。植物种子油脂合成途径已经较为清楚，但是调控花生种子油脂合成的分子机理仍不明确，因此阐明花生种子发育过程中油脂合成的调控机理，对花生高油育种有重要意义。我们前期研究中获得一个种子变小、种皮皱缩的花生突变体ｓｓｍ１，与对照亲本ＬＨ１１相比，该突变体种子含油量显著降低，“球形胚”时期的胚胎明显变小，且胚胎数目变少。ＬＨ１１和ｓｓｍ１种子发育不同时期的转录组数据表明，在糖酵解途径及脂肪酸生物合成和代谢途径存在显著富集，参与脂肪酸合成和代谢以及糖酵解途径的众多基因在ｓｓｍ１中表达显著下调[２０] 。为分析种子早期发育中的关键调控基因，本研究利用ｑＲＴ－ＰＣＲ技术分析了ＬＥＣ１等转录因子基因在突变体合子受精及种子发育时期的表达变化，以期为筛选导致突变表型的候选基因、解析花生发育和油脂积累的调控网络、深入研究调控花生油脂合成的分子机理及培育高含油量花生新品种提供参考。

１材料与方法

１.１植物材料

以山东省农业科学院农作物种质资源研究所特色作物资源与分子技术创新团队实验室保存的鲁花１１号（ＬＨ１１）及其突变体ｓｓｍ１作为试验材料。将ＬＨ１１用６０Ｃｏγ 辐照诱变，对收获的Ｍ２代种子进行调查，获得一个稳定遗传的小种子株系，命名为ｓｓｍ１（ｓｍａｌｌｓｅｅｄｍｕｔａｎｔ１）。

２０２０年４月底将ＬＨ１１与突变体Ｍ４代种子种植在山东省农业科学院试验基地，株距２０ｃｍ，行距５０ｃｍ，单粒播种[２１] 。播种１４０ｄ后收获，对单株结果数、单株幼果数、百果重和百仁重等性状进行统计分析。

于花生开花期和荚果发育不同阶段，采集开花之前未受精的子房（ＤＢＰ０）、受精１ｄ的子房（ＤＢＰ１）以及入土１０ｄ（ＤＡＰ１０）、２０ｄ（ＤＡＰ２０）、４０ｄ（ＤＡＰ４０）膨大的未成熟种子。采集的样品用液氮速冻后放入－８０ ℃冰箱保存。

１.２种子营养成分含量测定

含油量及蛋白质、脂肪酸的含量测定分别参照ＮＹ/ Ｔ１２８５—２００７、ＧＢ５００９.５—２０１６、ＧＢ５００９.６—２０１６规程进行，在中国科学院油料作物研究所完成。

１.３ＲＮＡ提取与ｃＤＮＡ合成

ＲＮＡ使用天根公司的ＲＮＡ提取试剂盒进行提取，然后利用艾瑞克生物公司的反转录试剂盒进行反转录合成ｃＤＮＡ。

１.４ｑＲＴ－ＰＣＲ检测

参照陈娜等[２２] 的方法和条件进行ｑＲＴ－ＰＣＲ。ｑＲＴ－ＰＣＲ的ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＰｒｅＭｉｘ试剂盒购自艾瑞克生物公司。ｑＲＴ－ＰＣＲ反应体系[２３] 为２０μＬ，包括２×ＳＹＢＲ? ＧｒｅｅｎＰｒｏＴａｑＨＳＰｒｅｍｉｘ１０μＬ，稀释至８ｎｇ/ μＬ的ｃＤＮＡ２ μＬ，正、反向引物各１ μＬ，ｄｄＨ２Ｏ６ μＬ。反应程序：９５ ℃ ３０ｓ、９５ ℃ ５ｓ，６０ ℃ ３０ｓ，４０个循环。以花生Ａｃｔｉｎ基因为内参，每个时期的样品重复３次，采用２－ΔΔＣｔ法[２４] 计算目标基因的相对表达量，用ｌｏｇ２ＦＣ[ｌｏｇ２（ＦｏｌｄＣｈａｎｇｅ）] 值表示基因相对表达的差异倍数。ｑＲＴ－ＰＣＲ所用引物见表１。

２结果与分析

２.１花生ｓｓｍ１突变体表型分析

籽仁大小是影响花生产量的重要农艺性状之一[２５] 。突变体ｓｓｍ１的荚果和种子明显小于ＬＨ１１，且种皮皱缩、颜色较深（图１）。以ＬＨ１１作为对照，对成熟后的突变体ｓｓｍ１的部分农艺性状进行分析，发现ｓｓｍ１的单株幼果数增多，单株结果数显著增加，分别较对照增加３８.４６％和８８.０４％、百果重、百仁重分别较对照降低６４.９６％、６０.３１％，差异达极显著水平、公斤仁数极显著增加，约是ＬＨ１１的２.５倍、虽然突变体ｓｓｍ１的结果数多，但由于种子变小，幼果数多，产量大幅度降低，单株生产力较ＬＨ１１降低３４.１１％（表２）。

２.２种子营养成分含量与脂肪酸的组成

对ｓｓｍ１和ＬＨ１１干种子粗蛋白含量、含油量和主要脂肪酸含量进行测定，结果（表３）表明，ｓｓｍ１的含油量显著降低，比ＬＨ１１降低１３.５３％。ｓｓｍ１突变体的粗蛋白、棕櫚酸、花生酸含量稍有升高，与ＬＨ１１差异较小、硬脂酸、油酸和亚油酸含量略降低，十七碳烷酸、十七碳一烯酸分别比ＬＨ１１降低３３.３３％、２５.００％，而亚麻酸、花生一烯酸、山嵛酸、芥酸、二十四碳烷酸含量明显升高。

２.３ＬＥＣ１等转录因子基因的表达

利用ｑＲＴ－ＰＣＲ分别检测了ＬＨ１１和突变体ｓｓｍ１中ＡｈＬＥＣ１Ａ、ＡｈＬＥＣ１Ｂ、ＡｈＦＵＳ３、ＡｈＡＢＩ３、ＡｈＡＧＬ１５、ＡｈＷＲＩ１基因在花生合子受精及种子发育不同阶段的表达情况，结果（图２）表明，在ＬＨ１１中，ＡｈＬＥＣ１Ａ、ＡｈＬＥＣ１Ｂ、ＡｈＦＵＳ３、ＡｈＷＲＩ１和ＡｈＡＧＬ１５在种子发育早期的表达总体上均呈现先上升后下降的趋势，而ＡｈＡＢＩ３的表达呈一直上升趋势。在ｓｓｍ１中，各基因表达水平明显低于ＬＨ１１，其中，ＡｈＬＥＣ１Ａ和ＡｈＡＢＩ３表达呈持续上调趋势、ＡｈＷＲＩ１在ＤＢＰ０—ＤＡＰ１０时期表达量升高，之后变化不大，各时期表达量均显著低于ＬＨ１１、其余基因表达变化趋势基本与ＬＨ１１中一致，且除ＡｈＬＥＣ１Ｂ在ＤＢＰ０和ＤＡＰ４０以及Ａｈ￣ＦＵＳ３在ＤＡＰ４０时期外，表达量均显著低于ＬＨ１１。ＡｈＬＥＣ１Ａ和ＡｈＬＥＣ１Ｂ在ＬＨ１１和ｓｓｍ１的未受精子房（ＤＢＰ０）中差异不明显，但是在ＤＢＰ１—ＤＡＰ２０时期，即受精后子房以及胚胎发育早期，在ｓｓｍ１中的表达显著下调，且ＡｈＬＥＣ１Ｂ表达量的升高具有明显的延迟性。其中，ＡｈＬＥＣ１Ａ在ＤＡＰ１０、ＤＡＰ２０时期表达量分别比ＬＨ１１降低５２.０４％、４５.４４％、ＡｈＬＥＣ１Ｂ在种子胚胎发育早期（ＤＡＰ１０）表达较ＬＨ１１大幅下调，降低７７.８８％。而ＬＥＣ１下游调控的转录因子基因ＡｈＦＵＳ３、ＡｈＡ￣ＧＬ１５在种子发育早期（ＤＢＰ０—ＤＡＰ２０时期）的表达量逐步升高，但ｓｓｍ１的表达量显著低于ＬＨ１１、ＡｈＡＢＩ３在ｓｓｍ１中的表达量明显低于ＬＨ１１，且除ＤＢＰ１外，均达显著水平。推测在ｓｓｍ１中，ＡｈＬＥＣ１可能作为上游关键调控因子，其表达下调引起ＡｈＦＵＳ３、ＡｈＡＢＩ３、ＡｈＷＲＩ１等下游转录因子基因表达量降低。例如，ＡｈＷＲＩ１在ｓｓｍ１种子发育过程中表达量显著降低，在营养物质积累的ＤＡＰ２０时期其在ｓｓｍ１中的表达量比ＬＨ１１下调８２.９４％。

３讨论与结论

ＬＥＣ１与植物胚胎发育和种子成熟密切相关，作为先驱转录因子在胚胎发育早期就被激活表达，原胚期和整个胚胎发生过程中都能检测到其表达[２６] ，是调控胚胎成熟过程的关键因子[２７] 。前期对ＬＨ１１和ｓｓｍ１的ＤＡＰ１０、ＤＡＰ２０、ＤＡＰ４０时期种子进行了转录组测序，发现与脂肪酸合成和代谢以及糖酵解相关通路中的众多基因在ｓｓｍ１中表达显著下调。本研究对ＬＥＣ１等转录因子基因的表达模式进行分析，发现ＡｈＬＥＣ１Ａ和ＡｈＬＥＣ１Ｂ在ｓｓｍ１合子受精和种子发育早期的表达与ＬＨ１１相比大幅度降低且表达延迟。另外，在子房受精之前，ＡｈＬＥＣ１Ａ、ＡｈＬＥＣ１Ｂ的表达量在ＬＨ１１和ｓｓｍ１中差异并不明显，但是受精后开始出现显著差异，直至ＤＡＰ４０时期两者之间又无明显差异，说明ＬＥＣ１在合子受精后开始对早期胚胎发育进行调控。

在ＬＥＣ１过表达的油菜和拟南芥中发现脂肪酸种类和脂质水平显著增加[１５] 、甘蓝型油菜ｌｅｃ１突变体中种子含油量下降，与糖酵解和脂肪酸修饰的相关基因表达下调[２８] 。ＷＲＩ１控制着多个糖酵解途径关键酶的基因以及参与脂肪酸合成的基因的表达。拟南芥ｗｒｉ１突变体中关于糖酵解和脂肪酸代谢相关酶活性降低，ｗｒｉ１种子的含油量降低８０％[２９] 。这些转录因子基因在胚胎和种子发育时期特异性表达，过量表达或抑制表达这些基因能提高含油量，证明了它们在调控种子脂肪合成方面的重要作用[１５，２８] 。在本研究中，ＡｈＬ￣ＥＣ１Ａ、ＡｈＬＥＣ１Ｂ正常表达的ＬＨ１１中其下游转录因子基因ＡｈＦＵＳ３和ＡｈＷＲＩ１在ＤＡＰ１０时期后大幅度升高、但是在ｓｓｍ１中，ＡｈＬＥＣ１Ａ、ＡｈＬＥＣ１Ｂ在ＤＢＰ１—ＤＡＰ２０时期表达下调且显著低于ＬＨ１１，ＡｈＦＵＳ３和ＡｈＷＲＩ１的表达量同样显著下调且表达量的升高出现延迟性，同时，受到ＬＥＣ１调控的ＡＢＩ３和调节ＦＵＳ３等基因表达的ＡＧＬ１５转录因子基因在ｓｓｍ１中的表达量也降低。ＤＡＰ１０—ＤＡＰ２０时期是养分物质积累的重要时期，在ＬＨ１１中ＬＥＣ１以及下游转录因子基因的表达趋势与油脂合成相关基因表达趋势一致，都呈上升趋势，与油脂积累同步、而在ｓｓｍ１中，ＬＥＣ１及其下游转录因子基因表达与ＬＨ１１相比在同时期显著下调，油脂合成相关基因表达也显著下调。作为ＬＥＣ１靶基因的ＷＲＩ１转录因子在花生小种子突变体ｓｓｍ１中表达显著降低，而受ＷＲＩ１转录因子调控的ＰＫｐ２Ｂ（丙酮酸激酶）在ｓｓｍ１种子中表达量几乎为零，糖酵解途径中ＦＢＰＢ（果糖－１，６－二磷酸酶）和ＰＦＫＢ（磷酸果糖激酶）基因在ｓｓｍ１中表达也显著下调[２０] ，影响了脂肪酸从头合成所需原料乙酰ＣｏＡ的正常合成。

ｓｓｍ１表現出种子皱缩、种皮颜色较深以及含油量下降的表型，这与拟南芥ｗｒｉ１突变体[２９] 和甘蓝型油菜ｌｅｃ１突变体[２８] 表型基本一致。可以推测，ＡｈＬＥＣ１Ａ、ＡｈＬＥＣ１Ｂ作为上游转录因子，其表达量的显著下调影响了ＡｈＦＵＳ３、ＡｈＡＢＩ３和Ａｈ￣ＷＲＩ１等下游转录因子的表达，进而影响了脂肪酸合成和代谢以及糖酵解途径中基因的表达，导致种子含油量明显降低。因此推测ＬＥＣ１基因参与了早期胚胎的发育调控，并且激活了下游转录因子的表达，共同参与脂肪合成和糖酵解途径。但是关于ＬＥＣ１及其下游转录因子如何调控脂肪合成通路还有待进一步研究。

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