西瓜枯萎病菌和哈茨木霉的GFP标记及根部动态定殖比较

孟素玲 王媛 顾欣 王新谱

摘 要 为明确西瓜枯萎病菌和生防哈茨木霉在西瓜根部动态定殖的差异，采用PEG-CaCl2介导的原生质体转化法，将携带绿色荧光蛋白基因的pCT74质粒分别与尖镰孢菌西瓜专化型和哈茨木霉M3菌株的基因组整合获得相应的转化子；将转化子接种于土壤，利用激光共聚焦显微镜示踪并比较两菌株转化子对西瓜幼苗根部的侵染动态过程。结果表明，转化子连续传代6次仍能发出绿色荧光且荧光强度稳定，能够稳定遗传，经PCR验证绿色荧光蛋白基因转入成功。盆栽试验中，两种转化子均能成功定殖于西瓜幼苗根部，在定殖初期，尖镰孢菌西瓜专化型在根内的扩散速度快于哈茨木霉M3菌株。

关键词 哈茨木霉；尖镰孢菌西瓜专化型；绿色荧光蛋白；定殖

西瓜枯萎病是由尖鐮孢菌西瓜专化型（Fusarium oxysporum f. sp. niveum，FON）侵染引起的土传病害，世界各地西瓜栽培区均有发病，且一旦暴发，严重影响西瓜产量甚至造成绝收［1］。利用生防木霉防控西瓜枯萎病已被证明是可行的绿色防控方法［2］。因此，两种微生物在植物根部的定殖及活性被学者们关注。

在植物与土传病害的关系中，病害发病时间和发病程度与病原菌在植株根部的定殖能力密切相关［3］。FON对植株根部的侵染始自孢子在根表皮的固着与萌发，随后菌丝侵入表皮，再沿着皮层细胞侵入维管束，通过维管束由根部继续向上侵染［4］。虽然FON的侵染情况与病原菌生物学特性和植株抗性有关，但是，枯萎病病情等级通常与FON在西瓜根内定殖的数量呈正相关［5］。针对FON的生物防控已筛选获得多种生防菌，其中哈茨木霉（Trichoderma harzianum）的研究和应用最多［6］。已知哈茨木霉对致病性镰刀菌的生防机制涉及竞争、重寄生、抗生作用、诱导植物抗性等，且都与木霉在植株根部的定殖紧密关联［7-8］。哈茨木霉在作物根部的定殖过程与镰刀菌相似，从孢子附着根表皮后萌发，然后菌丝逐步侵入皮层细胞，进而在根部维管束中定殖［9-10］。因此，作为土传病害的生防菌，木霉在土壤或寄主植物中的有效定殖对其发挥拮抗作用具有重要意义。

绿色荧光蛋白（Green fluorescence protein，GFP）标记技术可实现微生物-植物互作领域研究中的可视化跟踪，具有荧光性质稳定、直观、无需添加外源底物即可检测等优点［11］。该技术被用于多种病原菌和生防菌，如炭疽菌（Bacillus anthracis）［12］、镰孢菌［13］、芽孢杆菌（Bacillus）［14］和木霉菌［15］等的研究中。实现GFP标记的主要方法有PEG-CaCl2介导的原生质体转化法、电激法、基因枪法和农杆菌转化法。其中，PEG-CaCl2介导的原生质体转化法因转化效率高、操作简便、不受昂贵仪器限制等优点被广泛应用［16-17］。

已有研究明确了FON和生防哈茨木霉在不同植株根部定殖的基本规律，但是对两种微生物在相同生境、同种植物的根部动态定殖差异的认识尚不足。基于前期研究分离获得的生防哈茨木霉M3菌株，在对峙培养和盆栽试验中对FON均表现出较好的拮抗作用。为比较二者在西瓜根部的动态定殖差异，本研究采用PEG-CaCl2介导的原生质体转化法，分别构建含有潮霉素B磷酸转移酶基因（hygr）和绿色荧光蛋白基因（gfp）的哈茨木霉M3和FON转化子，并利用转化子示踪两菌株在西瓜根部的动态定殖，对比其侵染进程的差异，以促进对生防菌和病原菌在根际动态定殖的认识，为西瓜枯萎病的生物防控研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株与土壤来源 哈茨木霉M3菌株（NCBI编号ITS-JX473715，TEF1-MT809679，RPB2-MT809710）和FON均由宁夏大学农业微生物学实验室分离鉴定并保存。西瓜品种为‘金城5号。土壤取自宁夏中卫市兴仁镇红圈子村非耕作地，过2.0 mm筛，备用。

1.1.2 质粒与感受态细胞 含有潮霉素B磷酸转移酶基因（hygr）的质粒pCT74，购自淼灵质粒平台。扩增质粒所用的大肠杆菌感受态细胞Trans5a购自北京全式金生物技术有限公司。

1.1.3 引物 gfp基因的特异性引物P28（5′-TAGTGGACTGATTGGAATGCATGGAGGAGT-3′）/P29（5′-GATAGAACCCATGGCCTATATTCATTCAAT-3′）参照文献［18］，由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.1.4 培养基与试剂 马铃薯葡萄糖琼脂（Potato Dextrose Agar，PDA）培养基、马铃薯葡萄糖液体（Potato Dextrose Broth，PDB）培养基、LB琼脂培养基、LB液体培养基、再生培养基和水琼脂培养基的配制参考文献［19］。氨苄青霉素（Ampicillin，Amp）、潮霉素B（Hygromycin B，HmB）、崩溃酶（Driselase）购自北京索莱宝科技有限公司，真菌基因组DNA提取试剂盒（E.Z.N.A○RAFungal DNA Kit）购自美国omega公司，EcoTaq○[KG-*3/4][HT6”SS]RPCR SuperMix （+dye）、质粒提取试剂盒（EasyPure○[KG-*3/4][HT6”SS]R Plasmid MiniPrep Kit）购自北京全式金生物技术有限公司。STC溶液、PTC溶液和酶解液依据文献［19］配制。

1.1.5 仪器设备 ROX-250智能人工气候箱，Azure c200凝胶成像系统，DYY-6C型电泳仪，Olympus BX51荧光显微镜，Leica TCS SP5 型激光共聚焦扫描显微镜。

1.2 试验方法

1.2.1 M3野生型和FON野生型对HmB的敏感性测定 将4 ℃保存的M3菌株和FON分别接种于PDA培养基，28 ℃培养5 d。用灭菌打孔器打取直径5 mm的M3菌饼，分别接种至含0、200、400、600、800和1 000 μg/mL HmB的PDA培养基。用接种环挑取FON菌丝，采用点接法分别接种至含0、20、40、60、80、100、150、200   μg/mL HmB的PDA培养基。28 ℃培养8 d。每处理5个重复。观察不同处理的菌落生长情况，确定HmB对M3菌株和FON的最低致死浓度，为转化后的原生质体培养提供合适的HmB选择浓度。

1.2.2 质粒的提取 将pCT74质粒干粉3 000 r/min离心1 min后加入20 μL无菌水溶解；取1支100 μL的大肠杆菌感受态细胞，加入2 μL质粒，冰浴30 min后，42 ℃热激60 s，再冰浴  2 min；加入900 μL无抗生素的LB液体培养基，  37 ℃、180 r/min震荡培养45 min；6 000 r/min离心5  min，弃去多余上清液，留100 μL用于重悬细菌沉淀，并涂布至含Amp抗性的LB琼脂培养基上；37 ℃培养14 h；挑取单菌落至LB液体培养基中，加入Amp抗生素，220 r/min震荡培养14 h。质粒DNA提取方法按试剂盒的操作步骤进行，将提取的质粒DNA经10 g/L 琼脂糖电泳检测其纯度，-20 ℃保存，备用。

1.2.3 M3野生型和FON野生型的原生质体制备 原生质体的制备过程参照文献［20］，略作修改。用无菌水冲洗PDA培养7 d的M3菌株和FON，经纱布过滤后制成孢子悬液，吸取适量孢子悬液接种到PDB培养基中，28 ℃、140 r/min摇床培养12～15 h，用灭菌的滤纸过滤收集菌丝，并用0.8 mol/L NaCl反复冲洗。挑取0.1 g菌丝，加入1 mL 50 mg/mL的崩溃酶，充分混匀，28 ℃、140 r/min崩溃2～3 h，每隔0.5 h观察1次，直至镜检视野中无菌丝，即为崩溃完全。于4 ℃、3 000 r/min离心8 min，弃上清液，沉淀即为原生质体，并用STC重悬沉淀，将原生质体浓度调至1.0×108 mL-1。

1.2.4 PEG-CaCl2介导的原生质体转化

分别取200 μL M3菌株和FON原生质体，加20 μL质粒DNA，50 μL PEG，轻轻颠倒混匀，冰上放置30 min，缓慢滴入1 mL PEG，充分混匀，室温放置20 min，将原生质体悬浮液与15 mL再生培养基（含HmB）混合，倒至平板上，28 ℃过夜培养。在平板上分别铺10 mL含有1 000、150   μg/mL HmB的水琼脂培养基，28 ℃培养8 d后获得转化子。

1.2.5 M3转化子和FON转化子的筛选及稳定性检测 将“1.2.4”培养获得的M3转化子和FON转化子分别接种至含有1 000、150   μg/mL HmB的PDA培养基上，28 ℃培养5 d进行复筛，挑取菌丝在荧光显微镜下观察。选择荧光强度最高的菌落进行单孢分离，在不加HmB的PDA培养基中连续传代培养6代，再将M3转化子和FON转化子分别转接至含有1 000、150   μg/mL HmB的PDA培养基上，此时仍能正常生长且稳定发光的视为具有稳定遗传能力。

1.2.6 M3转化子和FON转化子的分子鉴定

将PDA培养基中培养5 d的转化子用无菌载玻片刮取菌丝至1.5 mL离心管中，采用真菌基因组DNA试剂盒提取DNA。以野生型菌株和清水为对照，利用gfp基因特异性引物P28/P29进行PCR验证，目的片段大小为417 bp。PCR反应体系（25 μL）：2×EcoTaq PCR SuperMix （+dye） 12.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 9.5 μL。反应条件：  94 ℃预变性5 min；94 ℃变性 45 s，58 ℃退火  1 min，72 ℃延伸 1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR产物经15 g/L 琼脂糖凝胶电泳检测，利用凝胶成像系统分析结果。

1.2.7 M3转化子和FON转化子在西瓜根部的定殖 挑选籽粒饱满的西瓜种子播种于装有营养土的育苗钵中，长至两叶一心时备用。将M3和FON活化培养6 d后，用无菌水冲洗菌落，经8层无菌纱布过滤，获得孢子悬液。以血球计数板法计数，配制孢子浓度为1×107 mL-1的M3和FON孢子悬液。营养钵（口径10 cm，底径6.5 cm，高10 cm）装土300 g/钵，每钵移植西瓜苗1株，保持土壤含水率约60%，置于日光温室，室温约24 ℃。采用灌根法分别接种M3孢子悬液和FON孢子悬液20 mL，每处理12株。在接种后第1、3、5、7天取植株全根，用无菌水多次冲洗至根表面没有土壤附着。将根置于载玻片上，利用激光共聚焦荧光显微镜（Confocal laser scanning microscope，CLSM）观察真菌转化子在西瓜根部的定殖状况。CLSM的激发光波长为488 nm/507 nm。

2 结果与分析

2.1 M3野生型和FON野生型抗生素浓度的  筛选

利用HmB对M3和FON的野生型进行敏感性测试。结果表明，随着HmB浓度的升高，野生型M3和FON菌丝生长受抑制程度显著增强。28 ℃培养条件下，HmB质量浓度为1 000    μg/mL时，M3菌丝无生长迹象（图1-a）。HmB质量浓度为150 μg/mL时，FON菌丝无生长迹象（图1-b）。因此，分别采用1 000 μg/mL和150   μg/mL HmB培养基作为M3转化子和FON转化子的筛选条件。

2.2 M3野生型和FON野生型原生质体的制备

利用崩溃酶处理M3和FON菌丝，发现M3菌株在崩溃处理2.5 h时原生质体产量最高（图2-a），FON在崩溃处理2 h时原生质体产量最高（图2-b）。

2.3 M3转化子和FON转化子的荧光稳定性  检测

挑選发光良好的哈茨木霉M3转化子和FON转化子进行荧光稳定性检测。经单孢分离，传代培养6代，将其转接至分别含有1 000、150 μg/mL HmB的PDA培养基上。两种转化子均生长良好，在荧光显微镜下呈现强烈的绿色荧光（图3）。

2.4 M3转化子和FON转化子的分子鉴定

采用引物P28/ P29对野生型M3、FON和传代培养后的转化子基因组DNA分别进行PCR扩增。结果表明，M3转化子和FON转化子分别扩增出1条大小为417 bp左右的目标片段，即图4中样品1的条带，与预期目标片段大小一致。野生型菌株和清水对照组均未扩增出片段，说明gfp基因已转入M3和FON菌株中。

2.5 M3转化子和FON转化子在西瓜根部的定殖

利用激光共聚焦显微镜观察M3转化子侵染西瓜根部的过程。结果表明，接种1 d，部分孢子吸附在西瓜根表面萌发，形成长芽管并逐渐伸长（图5-a）。第3天时，在植株根表面可以看到少量菌丝缠绕（图5-b）。接种至第5天，大量菌丝分布在根表面（图5-c），部分菌丝已经侵入表皮（图5-d）。至第7 天，根内部的菌丝进一步侵染扩散，已经沿着细胞间隙形成类网状结构，说明该菌株已完全定殖于植株根内（图5-e）。横切面图显示部分菌丝沿着皮层细胞已侵入到维管束（图5-f）。

FON转化子侵染西瓜根部的过程与M3菌株有相似之处。接种1 d，部分孢子附着于根表面并开始萌发，由芽管逐渐长成菌丝（图6-a），该现象主要集中在根毛区域。接种至第3 天，菌丝在表皮上生长蔓延，部分开始进入细胞间隙（6-b），且大量菌丝缠绕在植株根表面，呈现较强的荧光（图6-c），至第5天，菌丝穿过皮层细胞（图6-d），到达维管束（图6-e）。接种至第7天，FON转化子的菌丝已完全定殖于西瓜根内，围绕细胞生长的菌丝形成密集的类网状结构（图6-f）。

3 讨  论

确定真菌的抗生素最低致死浓度是实现GFP转化的重要步骤。研究表明，钩状木霉（T.hamatum）在HmB 质量浓度为50 μg/mL的平板上不能正常生长［9］。棉花枯萎病菌在HmB筛选压力300 μg/mL时成功获得含gfp的转化子［21］。本研究发现HmB对哈茨木霉M3菌株和FON的最低致死质量浓度分别为1 000 μg/mL和150 μg/mL，说明不同种类微生物的生物学特性导致其抗生素耐受性差异较大。以HmB作为抗性筛选标记，通常假转化子背景高［22］。为克服该缺点，本研究将初筛获得的转化子再次转接到含HmB的平板上进行复筛，以保证转化子的筛选有效性。同时对转化子继代培养6次后再转接到含HmB抗性平板上，结果显示转化子均生长良好。明确了两种微生物转化子的遗传稳定性，为后续相关研究提供了重要的材料。

原生质体的数量和质量是真菌gfp基因成功转化的关键。原生质体在制备过程中受多种因素影响，包括酶的浓度、酶解温度、稳渗剂、酶解时间和菌龄等［23-24］。菌丝的不同生长阶段和生理状态均影响原生质体的形成。新生菌丝在酶解过程中极易降解，过快释放导致原生质体破裂的几率增加。老化的菌丝通常细胞壁较厚，增加了酶解难度，造成原生质体产量较低［25-26］。因此，菌丝处于指数生长期是最佳的原生质体制备阶段［27］。本研究发现，哈茨木霉M3和FON的菌丝体分别在培养14 h和12 h时最有利于原生质体的生成。最适的酶解时间既能增加原生质体的产率，又不会因酶解时间过长导致细胞膜破裂［28］。本研究中，哈茨木霉M3的菌丝酶解时间超过  2.5 h，FON菌丝酶解时间超过2 h，都会导致原生质体的质量和数量降低。

通过GFP标记微生物，观察其侵染植物组织尤其是根部的过程，是微生物-植物互作关系研究中重要的一部分。利用钩状木霉GFP转化子研究其在辣椒幼苗根部的动态定殖。接种1 d后进行取样观察，发现该木霉已定殖于根表皮，3 d时菌丝侵染至植株根部维管束，第7 天时可观察到大量木霉菌丝定殖于根茎的交接处［9］。通过灌根接种致病性尖镰孢菌，观察其对地黄的侵染进程，发现接种84 h后，病原菌已通过伤口或毛孔等通道侵入植株根部，并迅速蔓延至维管组织，导致接种仅4 d的地黄就表现出枯萎症状［29］。Batista等［30］研究了尖镰孢菌菜豆专化型（Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli）转化子在菜豆根部的定殖，结果表明，病原菌首先接触的部位是根毛，第11 天时病原菌侵入细胞间隙，第19天时到达木质部导管，但发出的绿色荧光强度较弱。说明该致病菌主要在根冠的细胞间定殖，在木质部导管的定殖较弱。前人研究尽管明确了木霉菌或尖镰孢菌在某作物根部的侵染动态，但是不同试验选用的土壤、植物和其他环境条件具有较大差异，因此无法将两种微生物侵染作物根系的动态进行直接比较。本研究在相同土壤来源和栽培环境条件下，研究了哈茨木霉M3菌株和FON在西瓜根部的动态定殖，发现二者在根部的定殖既具有相似性又具有差异。接种后，M3和FON孢子均能在根表面附着并萌发；随着培养时间的增加，萌发的芽管逐渐生成大量菌丝，由表皮逐渐侵入皮层细胞，然后到达维管束组织。以上定殖的整体规律与前人研究较为相似。但是，不同时间段的荧光影像表明，M3菌株和FON在西瓜根部的侵染进程具有差异。接种第3 天，已有部分FON菌丝进入细胞间隙，而同时期M3菌株处理未见该现象。至第5 天，M3的菌丝出现在细胞间隙，但是FON菌丝已大量侵入皮层细胞和维管束。M3菌丝在第7 天时才定殖到维管束中。说明病原菌FON在西瓜根部的定殖侵染较哈茨木霉M3菌株更快。这可能是致病性尖镰孢菌能够快速导致寄主植物发病和该类病害防治难度较大的重要原因。未来在利用哈茨木霉开展枯萎病的生物防治时，还需考虑两种真菌在根际复杂的互作关系。

4 结  论

本研究通过PEG-CaCl2介导的原生质体转化法，成功获得能够稳定表达gfp的哈茨木霉转化子和FON转化子，二者都能通過表皮侵入西瓜根部维管束组织。在接种7 d内，FON的定殖和侵染较哈茨木霉更快。这可能是FON能够快速导致西瓜发病和西瓜枯萎病防治难度较大的重要原因。本研究结论将促进人们对哈茨木霉和FON在寄主植物根部定殖的重新认识。

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Comparison of GFP Markers and Root Dynamic Colonization of Fusarium oxysporum f. sp. niveum  and Trichoderma harzianum in Watermelon

Abstract To clarify the differences in colonization dynamics of watermelon roots by Fusarium oxysporum f. sp. niveum （FON） and Trichoderma harzianum ，the protoplast mediated by PEG-CaCl2 method was used to integrate the pCT74 plasmid carrying the green fluorescent protein （GFP） gene， so as to obtain the corresponding transformants with the genomes of FON and T.harzianum M3 strains，respectively.The transformants were inoculated in soil，and laser scanning confocal microscope （ LSCM） was used to trace and compare the dynamic of root infestation of watermelon seedlings by the two strains.The results showed that the transformants could still emit green fluorescence with stable fluorescence intensity for six consecutive passages and could be inherited stably，and the green fluorescent protein gene was successfully transferred by PCR. In this experiment，both transformants were successfully colonized in the roots of watermelon seedling. At the early stage of colonization，the FON spread faster in the roots than the T.harzianum M3 strain. The relationship between Trichoderma，FON and host plants，environment provides a basis for clarifying the colonization pattern of Trichoderma.

Key words Trichoderma harzianum; Fusarium oxysporum f. sp. niveum; Green fluorescent protein; Colonization