鸡血藤纤维样物质药用价值的研究与评价

吴国学,武天坤,李小霞,杨书婷,刘栋,董靖,张思森,郝义彬,王一硕

[1.河南中医药大学第五临床医学院(郑州人民医院),河南 郑州 450003;2.河南省人民医院,河南 郑州 450000;3.河南中医药大学,河南 郑州 450046]

鸡血藤是豆科植物密花豆的干燥藤茎,在传统中医中已有数百年的历史,主产于中国的广东、广西和东南亚一些国家,具有活血补血、调经止痛、舒筋活络等功效[1-3]。鸡血藤含有多类化学成分,其中黄酮类成分儿茶素、表儿茶素等化学成分是鸡血藤发挥抗炎、抗氧化、抗肿瘤、保护心脑血管、降血糖和调节内分泌等多种药理作用的物质基础[4-5]。但在临床应用中,经常需要将鸡血藤饮片粉碎,过筛后的细粉用于制丸或制颗粒,但粉碎时会产生大量纤维样残渣,不易过筛,这部分入丸剂会导致丸剂表面粗糙,影响患者服用口感,且纤维样残渣中的化学成分及含量尚不明确,为明确鸡血藤粉碎过程中未能过筛的纤维样物质是否具有回收再利用价值而进行了该研究,以期为以后同类型的中药饮片的粉碎回收利用提供参考依据。

1 仪器与试药

F-30B型万能粉碎机及不同目数的工业筛;3号、4号、5号、6号药典筛;TL-650CT型超声提取仪;高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)仪(Agilent1200系列);甲醇、乙腈为色谱纯,双蒸水为超纯水,磷酸为分析纯。儿茶素对照品(江苏永健医药科技有限公司,批号200029-160914)。鸡血藤样品为采购自6个不同厂家、包装规格为1 kg的鸡血藤饮片,由河南中医药大学张振凌老师鉴定为鸡血藤正品。

2 方法与结果

2.1 粉碎及过筛

2.1.1粉碎

不同厂家的6 袋鸡血藤饮片分别编号,掰成小块、不装筛网,直接用万能粉碎机粉碎打成小块(预粉碎)。将预处理的每份样品粗块分成两份,每份约500 g,分2次过20 目工业筛,中间要将未能过筛的纤维掏出,分装已过20目工业筛的粗粉和未过20 目工业筛的纤维,并分别标号。再将已过20目工业筛的粗粉、未过20目工业筛的纤维依次过80目工业筛,收集最终过80目工业筛的细粉和不能过80目工业筛的纤维样物质,分别称重。结果表明鸡血藤饮片使用万能粉碎机粉碎过80 目工业筛产生平均84.9%细粉和15.1%的纤维样物质,两部分的重量和占比详见表1。

表1 鸡血藤饮片经万能粉碎机粉碎后细粉、纤维样物质产出情况

2.1.2过筛

将“2.1.1”项粉碎后过80目工业筛的细粉、纤维样物质再过6号药典筛(100目)。为了取样的科学性,采用均等四分法、对角线取样。分别称量上述过80目工业筛的原细粉经6号药典筛过筛后产生的细粉、纤维样物质重量,称量上述不能过80目工业筛的原纤维样物质经6号药典筛过筛后产生的细粉、纤维样物质重量,并计算各自的占比,结果见表2、表3。

表2 原细粉经6号药典筛过筛后细粉和纤维样物质 重量及占比

从表2、表3可知,经过80目工业筛产生的细粉,再用6号药典筛(100目)过筛,筛下来的细粉占比72.1%,纤维样物质占比27.9%;而不能经过80目工业筛产生的纤维样物质,再用6号药典筛(100目)过筛,筛下来的细粉占比26.9%,纤维样物质占比73.1%。

表3 原纤维样物质经6号药典筛过筛后细粉和 纤维样物质重量及占比

2.2 浸出物测定

按《中国药典》2020年版四部“2201 浸出物测定法”[6]测定“2.1.2”项所得细粉、纤维样物质(批次1)的浸出物含量。取供试品约2 g,精密称定,置100 mL锥形瓶中,精密加乙醇50 mL,密塞,称定重量,静置1 h后,连接回流冷凝管,加热至沸腾,并保持微沸1 h。放冷后,取下锥形瓶,密塞,再称定重量,用乙醇补足减失的重量,摇匀,用干燥滤器滤过,精密量取滤液25 mL,置已干燥至恒重的蒸发皿中,在水浴上蒸干,于105 ℃干燥3 h,置干燥器中冷却30 min,迅速精密称定重量。以干燥品计算供试品中醇溶性浸出物含量。结果显示,无论是过80目工业筛,还是过6号药典筛,所得细粉的乙醇浸出物含量均远高于纤维样物质,见表4。

表4 浸出物测定结果

2.3 水分测定

按《中国药典》2020年版四部“0832 水分测定法”第二法(烘干法)[6]测定“2.1.2”项所得细粉、纤维样物质(批次1)的水分含量。取供试品2～5 g,平铺于干燥至恒重的扁形称量瓶中,厚度不超过5 mm,精密称定,开启瓶盖在100～105 ℃干燥5 h,将瓶盖盖好,移置干燥器中,放冷30 min,精密称定,再在上述温度干燥1 h,放冷,称重,至连续两次称重的差异不超过5 mg为止。根据减失的重量,计算供试品中含水量(%)。结果显示,无论是过80目工业筛,还是过6号药典筛,所得细粉、纤维样物质的水分含量均未有明显差别,并且都符合药典中鸡血藤饮片项水分含量限值要求(不得过13.0%)。见表5。

表5 水分测定结果

2.4 含量测定

2.4.1色谱条件

色谱柱:Agilent C18柱(4.6 mm×100 mm,2.6 μm)。流动相:乙腈-0.2%磷酸溶液(10∶90);流速为1.3 mL·min-1;柱温为25 ℃;检测波长为278 nm;进样量为10 μL;理论板数按儿茶素峰计算应≥3 000。

2.4.2对照品溶液的制备

取儿茶素对照品适量,精密称定,用50%(体积分数)甲醇溶解并定容至刻度,制成含儿茶素0.12 g·L-1的对照品溶液。配置好的对照品溶液放置于冰箱中,防止氧化变质。

2.4.3供试品溶液的制备

取本品粉末约1.0 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入50%甲醇50 mL,称定重量,超声处理(功率100 W,频率50 kHz)30 min,放冷,再称定重量,加50%甲醇补足减失的重量,滤过,滤液蒸干,残渣用50%甲醇溶解并转移至2 mL量瓶中,加50%甲醇稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得。

2.4.4系统适用性试验

分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μL,在上述色谱条件进样测定,记录色谱图,见图1、图2。结果显示,儿茶素与相邻成分分离度良好(>1.5),理论板数按儿茶素峰计算>3 000。

HPLC为高效液相色谱。

HPLC为高效液相色谱。

2.4.5线性关系考察

取“2.4.2”项儿茶素对照品溶液(0.12 g·L-1),在上述色谱条件下依次进样5、10、15、20、25 μL,记录色谱图,测定峰面积。以峰面积(y)对进样量(x)进行线性回归,得回归方程y=334 542x-8 318.3,相关系数r=1。结果表明在0.6～3.0 μg范围内,儿茶素峰面积与进样量线性关系良好。详见表6。

表6 线性关系考察结果

2.4.6精密度试验

取“2.4.3”项同一供试品溶液,按上述色谱条件下,连续进样6次,记录色谱峰峰面积和保留时间。结果显示儿茶素峰保留时间的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)为0.31%,峰面积的RSD为0.82%,表明仪器精密度良好。见表7。

表7 精密度试验结果

2.4.7重复性试验

取同一批鸡血藤饮片细粉,按“2.4.3”项方法平行制备6份供试品溶液,然后按上述色谱条件进样测定,记录色谱图,并计算儿茶素含量。结果显示,儿茶素的平均含量为0.198 7 mg·g-1,RSD为1.89%,表明上述方法重复性良好。见表8。

表8 重复性试验儿茶素含量

2.4.8稳定性试验

取“2.4.3”项同一供试品溶液,在室温下放置0、2、4、6、8、12 h时,按上述色谱条件进样测定,记录色谱图。结果显示,儿茶素峰面积的RSD为1.63%,表明供试品溶液配制后室温下放置12 h内稳定性良好。见表9。

表9 重复性试验结果

2.4.9回收率试验

取同一批已知儿茶素含量的鸡血藤饮片细粉6份,每份约0.5 g,精密称定,分别加入相当于100%水平的儿茶素对照品,按“2.4.3”项方法制备供试品溶液,然后按上述色谱条件进样测定,记录色谱图并计算得出儿茶素含量为1.79%,平均RSD为99.32%,见表10。

表10 儿茶素加样回收率试验结果

2.4.10样品中儿茶素含量测定

取以下6种样品:(1)“2.1.1”项鸡血藤饮片用万能粉碎机粉碎、经80目工业筛过筛后所得的原细粉、原纤维样物质;(2)“2.1.2”项原细粉经6号药典筛(100目)过筛后产生的细粉、纤维样物质;(3)“2.1.2”项原纤维样物质经6号药典筛(100目)过筛后产生的细粉、纤维样物质。分别按“2.4.3”项方法制备供试品溶液,然后上述色谱条件进样测定,记录色谱图并计算儿茶素含量。结果见表11。

表11 鸡血藤饮片粉碎后各过筛样品中儿茶素含量 测定结果(mg·g-1)

3 讨论

3.1 课题研究目的

鸡血藤是活血养血常用中药,临床常用于治疗月经不调、血虚萎黄、麻木瘫痪、风湿痹痛等,为“血分之圣药”,其主要活性成分为黄酮类(如儿茶素)[5]。经文献检索,有关鸡血藤化学成分含量测定、提取分离、药理的研究较多,但对鸡血藤粉碎后未能过筛的纤维样物质尚未有研究,为明确其是否具有再回收利用价值进行了该项研究。

3.2 鸡血藤饮片粉碎后过筛研究

鸡血藤饮片用万能粉碎机粉碎后,产生了大约15.1%的纤维样物质。上述纤维样物质再分别用3号、4号、5号药典筛过筛,发现过筛后细粉中纤维样物质仍然较多。最后采用6号药典筛(100 目)过筛,发现纤维样物质较少,故“2.1.2”项的过筛过程采用6号筛。

3.3 含量测定指标成分的选择

陆雪丽等[7]用HPLC法对鸡血藤中的主要有效成分儿茶素和表儿茶素总量进行了测定;谭潇等[8]对鸡血藤乙醇提取物及其活性成分儿茶素的抗辐射作用进行了研究,并探讨了初步作用机制;张敏等[9]用快速液相色谱法同时测定了鸡血藤药材中原儿茶酸、儿茶素、表儿茶素的含量;刘超等[10]建立了鸡血藤中儿茶素类化合物的含量测定方法;Lee等[11]研究了鸡血藤提取物的抗血小板作用机制;刘屏等[12]提取了鸡血藤中的儿茶素类成分,发现其在血液系统方面对造血祖细胞内源性增殖缺陷有缓解作用,是鸡血藤发挥补血活血的重要物质基础。上述研究均表明儿茶素是鸡血藤饮片中含量较高的黄酮类成分,也是其发挥补血活血药效的主要成分,还是鸡血藤指纹图谱中的特征成分,所以本研究将儿茶素作为本研究的指标成分。

3.4 含量测定用供试品溶液制备方法的选择

在选择提取溶剂时,考虑到乙醇提取液中杂质较多,可能会对儿茶素含量测定产生影响。在查阅相关文献[13-15]的基础上,选用50%甲醇作为提取溶剂。在提取方式上,超声提取比回流提取方便快捷,且不会因为加热导致供试品中成分发生变化,故选择超声提取。

3.5 鸡血藤饮片粉碎后各过筛样品中儿茶素含量差异分析

从表9可知,儿茶素含量在各过筛样品的细粉和纤维样物质中差异显著。经计算三批样品中,原细粉和原纤维样物质中儿茶素含量比值分别为1.65、1.37、1.43;原细粉过6号药典筛后产生的细粉和纤维样物质中儿茶素含量比值为1.52、1.56、1.46;原纤维样物质过6号药典筛后产生的细粉和纤维样物质中儿茶素含量比值为1.51、1.63、1.34。

4 结论

在制药过程中,鸡血藤饮片经常要打粉,会产生很多纤维样物质,直接用于制颗粒、制丸,患者反映口感较差。经上述研究表明,鸡血藤饮片经万能粉碎机粉碎后产生大约15.1%的纤维样物质;万能粉碎机粉碎后过6号药典筛,筛下来的细粉中含有的纤维样物质较少,适宜制药;各过筛样品细粉和纤维样物质中水分含量基本一致,均符合药典要求;各过筛样品细粉的乙醇浸出物含量均远高于相应的纤维样物质;各过筛样品细粉的儿茶素含量是相应纤维样物质的1.34～1.65倍。综合如上研究结果,鸡血藤饮片经万能粉碎机粉碎,再过6号药典筛后,筛分下来的纤维样物质可以舍弃。

在临床使用过程中,千年健、乌药、甘草等众多中药饮片经粉碎后也会产生大量纤维样物质,本文的研究结果给这类饮片的后处理提供了一定的参考依据。