PCNA在子宫内膜癌组织中的表达及临床意义

2024-03-23郑春兰王文文何政霞张婵丽唐智华王艳马骞郭红军

河南医学研究 2024年4期

郑春兰,王文文,何政霞,张婵丽,唐智华,王艳,马骞,郭红军

(郑州大学第一附属医院妇科,河南郑州 450052)

子宫内膜癌(uterine corpus endometrial carcinoma,UCEC)是一种常见的生殖系统恶性肿瘤,严重威胁着女性的健康,发病率呈上升趋势,目前关于UCEC的发生发展机制尚未明确。细胞无限制增殖是肿瘤的主要特点[1]。细胞增殖核抗原(proliferation cell nuclear antigen,PCNA)是一种常见的细胞增殖标志物,在不同肿瘤中与临床表型指征密切相关,在合成DNA中发挥着重要的作用,特别是在细胞G1期到S期过程中[2]。多项研究报道PCNA基因异常表达在不同恶性肿瘤的发生发展、转移等致病过程中发挥着重要的作用[3-5]。目前UCEC组织中有关于PCNA的研究鲜有报道。本研究通过挖掘肿瘤基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库和UALCAN数据库实验分析PCNAmRNA及PCNA蛋白在UCEC中的表达情况,并利用免疫组化加以验证,最后应用生物信息学方法预测PCNA在UCEC中潜在的作用机制。

1 资料与方法

1.1 TCGA数据库中PCNA mRNA表达水平及临床数据

从UCSC Xena数据库(http://xena.ucsc.edu/)中下载TCGA数据信息,并获得UCEC患者PCNAmRNA表达水平及相关临床信息(年龄、临床分期、组织学类型、治疗结果、残留肿瘤分级、组织学分级、肿瘤侵袭比率、放射治疗),共587例原发性UCEC样本信息(包括552例肿瘤组织和35例癌旁组织)。对原始数据进行标准化处理,剔除不完整资料,然后通过基因作图进行注释和筛选。采用受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线判断PCNA对UCEC的诊断价值,并计算曲线下面积(area under curve,AUC)值。

1.2 UCEC患者的临床标本

收集2020年1月至2022年12月郑州大学第一附属医院妇科术后20例UCEC组织和20例正常组织。术中取UCEC组织,并在距离癌边缘约1 cm处切取大小1 cm3的癌旁组织,组织标本采集后置于40 g·L-1的多聚甲醛固定液中保存,待后续检测使用。本研究对20例UCEC进行了组织病理学评估,其组织病理类型为子宫内膜样癌(16例)、透明细胞癌(2例)、浆液癌(1例)和黏液癌(1例)。16例子宫内膜样UCEC中,10例为普通型,4例为绒毛腺型,2例为鳞状分化。

1.3 纳入和排除标准

纳入标准:(1)初诊为UCEC,术后组织学病理确诊为UCEC,病理结果由2名专业病理科医生复核;(2)手术前未接受放化疗和免疫治疗;(3)无其他恶性肿瘤病史;(4)有详细的随访信息;(5)年龄>18岁,同意加入研究。排除标准:(1)孕期或哺乳期;(2)疾病发展过程中伴有新生血管疾病;(3)患有可能影响研究结果的内分泌疾病;(4)合并子宫内其他种类疾病。最终纳入20例UCEC术后石蜡病理切片标本和20例正常子宫内膜组织标本,年龄39～68岁。

1.4 免疫组化

取保存术后组织,进行石蜡包埋,对切片进行脱蜡和水化处理,使用枸橼酸钠进行抗原修复,双氧水溶液阻断内源性过氧化物酶活性,BSA封闭后孵育一抗(过夜)、二抗(1 h)。染显、复染、脱水、树胶封闭后于镜下观察PCNA蛋白染色情况并拍照。

1.5 单因素相关性分析

下载TCGA数据库中level 3 HTSeq-FPKM格式的RNAseq数据,采用R语言(3.6.3版本)stat包对相关基因表达进行单因素相关性分析,将差异性基因分析结果用于后期通路预测分析。

1.6 UALCAN数据库和基因富集分析

UALCAN(http://Ualcan.path.uab.edu/)是一个基于TCGA数据库分析的在线分析平台[6]。点击TCGA模块,搜索PCNA在UCEC中的mRNA表达水平;点击CPTAC模块,分析PCNA在UCEC中的蛋白水平。基因集富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA)是一种基因探针富集分析法,基于对芯片和测序数据对两组间基因集合进行富集评估,在RNA水平挖掘影响肿瘤疾病的基因信号通路。根据1.5单因素分析结果,采用GSEA进行相关通路预测,探索PCNA基因在UCEC中可能影响的相关信号通路及相关因子[7]。选择分子标签数据库中的基因集作为背景,运算分析次数为1 000次,采用计算富集分数和标准化富集分数来评估两组差异价值。以P<0.05和错误发现率<0.25为评价指标,视为差异有统计学意义。

1.7 PCNA表达水平与临床特征的相关性分析

下载TCGA数据库中level 3 HTSeq-FPKM格式的RNAseq数据,采用R语言(3.6.3版本)stat包对相关基因表达进行分析。收集UCEC临床信息中患者年龄、病理学分级、组织学分级、手术方法等临床特征,删除临床数据不完整的样本。采用单/多因素Cox回归计算所研究变量的风险比率(hazard ratio,HR),并探索PCNA基因表达水平作为预后因素的独立性。

1.8 PCNA表达水平与UCEC中免疫细胞浸润丰度的相关性分析

基于TIMER2.0肿瘤免疫评估数据库(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)[8]的肿瘤基因表达模块,检索UCEC中PCNA基因与CD8+T细胞、CD4+T细胞、B细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞等浸润免疫细胞的关联性,并采用Spearman法处理分析数据。TIMER2.0还可以检索PCNA在TCGA数据库中所有癌症组织和癌旁组织中的表达。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 PCNA mRNA表达水平

PCNA在UCEC组织和正常组织中得表达水平分别为7.799±0.975、6.494±0.342。PCNA在UCEC组织中的表达水平高于癌旁正常组织,差异有统计学意义(P<0.001),见图1。ROC曲线分析结果可知,PCNA基因表达水平对UCEC具有诊断价值(AUC=0.875,95% CI 0.835～0.915),见图2。

***P<0.001;TCGA为肿瘤基因组图谱;PCNA为细胞增殖核抗原;UCEC为子宫内膜癌。

PCNA为细胞增殖核抗原;UCEC为子宫内膜癌。

2.2 PCNA蛋白表达水平

UALCAN数据库挖掘分析结果显示,相对比正常组织,PCNA蛋白在UCEC组织中高表达(P<0.001)。免疫组化技术进一步验证挖掘结果,结果显示PCNA蛋白在UCEC组织中高表达,并且主要定位于细胞核中,见图3、4。

PCNA为细胞增殖核抗原;UCEC为子宫内膜癌。

2.3 单因素/多因素回归分析结果

对TCGA数据库患者临床信息进行单/多因素Cox回归分析,单因素Cox回归结果显示年龄(P=0.009)、临床分期(P<0.001)、组织学类型(P<0.001)、主要治疗结果(P<0.001)、残留肿瘤(P<0.001)、组织学分级(P<0.001)、肿瘤侵袭度(P<0.001)、放射治疗(P<0.05)、PCNA表达(P=0.046)有统计学意义。多因素Cox回归分析显示,年龄(P=0.007)、临床分期(P<0.001)、放射治疗(P=0.003)可以作为UCEC潜在的预后因素。见表1。

A为正常内膜组织; B为UCEC组织;PCNA为细胞增殖核抗原;UCEC为子宫内膜癌。

表1 UCEC患者单/多因素Cox回归分析结果

2.4 GSEA富集结果

利用GSEA预测PCNA在UCEC中参与调控的通路发现PCNA与细胞周期、同源重组、DNA修复、DNA复制、错配修复、DNA损伤反馈、G1_S DNA损伤检测点、G2_M DNA损伤检测点、有丝分裂G1期与G1_S转变、T细胞信号转导,以及B细胞受体信号通路,见图5。

GSEA为基因集富集分析。

2.5 PCNA与UCEC中免疫细胞浸润的关系

采用TIMER 2.0数据库分析,结果表明PCNA表达水平和UCEC中CD8+T细胞(rho=-0.234)、巨噬细胞(rho=-0.243)、树突状细胞(rho=-0.257)、调节性T细胞(rho=-0.267)的浸润水平呈负相关(P<0.05),与CD4+T细胞(rho=0.281)、中性粒细胞(rho=0.253)浸润水平呈正相关(P<0.05)。见图6。

PCNA为细胞增殖核抗原。

2.6 STRING在线分析

PCNA基因可以翻译成蛋白质行使生物学功能。利用STRING在线分析预测PCNA与相关蛋白的相互作用,得到以PCNA为中心的蛋白质互作网络图,见图7。蛋白质互作网络图主要包括KIAA0101、CDK4、RFC2、FEN1、POLD3、RPA1、CDK2、RFC3、POIH、LIG1等10个基因,其中共涉及44个相互作用节点,P<0.001。

PCNA为细胞增殖核抗原。

3 讨论

UCEC是女性恶性程度较高的泌尿生殖系统肿瘤之一。随着人们生活水平的提高,女性生活节奏以及饮食结构调整等因素导致UCEC的发生率明显升高,并且呈现年轻化的趋势。UCEC初期隐匿性较强,通常以息肉等良性肿瘤被发现,且缺乏有效的诊断标志物。伴随着疾病的进展,绝大多数患者会出现激素异常、月经周期失调以及排尿困难等症状,严重影响患者的生活质量和生育需要。因此,迫切寻找特异的标志物可优化UCEC的早期诊断和治疗。

PCNA是1978年由Miyachi首次从系统性红斑狼疮患者血清中发现,因存在于增殖性细胞中而得名。PCNA基因编码的蛋白是一个高度保守的环状同型三聚体蛋白,能与细胞DNA复制、DNA损伤修复、细胞周期调控、染色体重组、DNA甲基化以及细胞凋亡等功能密切相关,特别是在G1晚期到S期间[9-11]。当细胞中的双螺旋DNA受到外环境或细胞内产生的毒性物质的损伤时,细胞中的DNA损伤将有可能产生DNA双链断裂,该损害由于未得到有效的修复,因此断裂的双链DNA将会诱导细胞死亡,DNA双链断裂的错误修复与基因组不稳定性也会增加肿瘤的发生概率[12]。PCNA作为一个稳定的载体平台,在DNA损伤修复过程中发挥着重要作用。PCNA可作为DNA聚合酶polδ的辅助蛋白结合参与DNA复制,当DNA复制过程中遇到DNA损伤时,PCNA可通过泛素化及类泛素化等多种翻译后修饰对DNA损伤修复进行调控[13]。Bellí等[14]报道,当表皮细胞长时间暴露于紫外线辐射中,RAD6-RAD18蛋白复合体能够介导PCNA蛋白的164位Lysine发生泛素化,进而导致DNA聚合酶发生结构改变,包括DNA聚合酶Y家族跨损伤合成酶中的polδ和pol蛋白[15]。当细胞发生紫外线辐射损伤时,PCNA蛋白的164位Lysine会发生单泛素化,这使结合于PCNA上的DNA聚合酶polδ转换成pol[16]。在无损伤条件下,DNA pol的泛素结合锌指结构域被单泛素化,当DNA遭受紫外线辐射损伤后,pol被去泛素化,结合在泛素化的PCNA上。这些研究结果表明PCNA表达的失调可能与多种癌症的发生、发展及预后密切相关,但目前尚未有研究对PCNA与UCEC的关系进行综合分析。

为了探究PCNA与UCEC的调控关系,本研究通过TCGA数据库发现PCNA在多种肿瘤中高表达,如乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌等,这与既往研究结果一致。Juríková等[5]发现,PCNA在乳腺癌组织中上调。Lü等[17]发现,高表达PCNA作为独立的预后因素,能够预测宫颈癌和神经胶质瘤肿瘤预后不良。但关于PCNA与UCEC发生、发展的关系尚未被阐明。进一步分析发现,基于TCGA数据库,在mRNA和蛋白水平,均发现PCNA在UCEC中高表达,且差异具备诊断价值。临床特征的相关性分析表明,PCNA与UCEC患者年龄、肿瘤分级、组织学分级等相关。以上结果提示PCNA可能作为促癌基因发挥功能,在UCEC的发生、发展中发挥着重要作用,提示PCNA可作为UCEC潜在的诊断和预后标志物。

为进一步探讨PCNA参与调控UCEC进展的机制,本研究通过STRING在线分析预测PCNA与相关蛋白的相互作用,得到以PCNA为中心的蛋白质互作网络图,发现KIAA0101、CDK4、RFC2、FEN1、POLD3、RPA1、CDK2、RFC3、POIH、LIG1基因与PCNA呈高度相关,共表达基因参与多种肿瘤的发生与发展。据报道,CDK4与肿瘤的组织学分化、临床分期和预后密切相关,可作为有价值的诊断标志物[18]。POLD1作为DNA复制和修复中的重要调控因子,在肿瘤的治疗和病理学检验中有潜在的应用价值[19]。因此,推测PCNA可能通过复杂的分子互作功能参与肿瘤进展的调控。通过单因素相关分析和基因功能富集分析,结果显示,PCNA基因表达相关性基因主要富集在DNA修复、DNA复制、错配修复、DNA损伤反馈、同源重组,以及细胞周期调控等生物学功能。这个预测结果和前期诸多研究中PCNA作为同源重组与DNA修复功能重要蛋白的结论是一致的,可见PCNA可能参与了同源重组、DNA修复等多种途径影响UCEC的发生和发展。

肿瘤微环境是癌症进展、调控的重要因素,许多研究证实其在预测肿瘤患者生存状态和治疗效果方面具有重要临床意义。肿瘤免疫微环境是肿瘤细胞赖以生存和发展的内环境,肿瘤浸润免疫细胞调节肿瘤的免疫状态,免疫细胞参与了肿瘤的进展和转移过程。近年来受到研究者的重视,研究者们发现UCEC的发生、发展、转移、复发和治疗耐药与免疫反应密切相关[20-21]。本研究通过对TIMER 2.0数据挖掘,发现PCNA基因表达与UCEC中CD8+T细胞、CD4+T细胞、树突状细胞、调节性T细胞等免疫细胞的浸润水平呈现负相关,与中性粒细胞浸润水平呈现正相关。肿瘤微环境中的一些免疫因子和细胞炎症成分能够引起树突状细胞的功能异常,从而导致了肿瘤细胞的免疫逃逸,这对于肿瘤的发生、发展至关重要[22]。本研究分析结果提示,PCNA可能通过影响树突状细胞等免疫细胞促进UCEC的进展。肿瘤相关巨噬细胞可调控UCEC细胞免疫应答以及影响相关细胞因子,并参与了UCEC的进展[20],而巨噬细胞侵袭能力增加,通常与UCEC患者预后较差有关[23]。本研究还通过GSEA分析表明,PCNA高表达与T细胞信号转导、B细胞受体信号通路相关。本研究结果预测可见PCNA可能是通过影响免疫细胞浸润功能、细胞外基质调控等多种途径影响UCEC的进展、复发和治疗抗性,其中具体的作用机制则有待于进一步研究。