衢州市单中心儿童肺炎链球菌感染流行及血清型分布特征研究

杨云飞 邱玉萍 程颖 李梦萍 朱扬帆 王燕飞 刘林 陆军

肺炎链球菌是社区获得性感染的重要病原体，也是引起儿童细菌性肺炎、鼻窦炎、菌血症的主要病原体。肺炎链球菌有90 多个血清型，在全球范围内，6～11 种血清型可引起70%以上5 岁以下儿童的侵袭性肺炎链球菌病（invasive pneumococcal disease，IPD）[1]，不同地区儿童携带或感染肺炎链球菌的血清型也有所不同[2]。肺炎链球菌多糖结合疫苗（polysaccharide conjugate vaccine，PCV）能够有效刺激小儿免疫系统，产生足够的保护性抗体，并具有免疫记忆[3]。了解衢州地区儿童感染肺炎链球菌的临床特征和血清型，将有助于指导推广疫苗和临床用药。本研究收集衢州市人民医院引起儿童感染的107 株肺炎链球菌，对其进行血清型鉴定，为疫苗推广及肺炎链球菌疾病（pneumococal disease，PD）的防治提供依据。

1 资料和方法

1.1 菌株来源分离及鉴定 收集2020 年1 月至2022年6 月衢州市人民医院16 岁以下肺炎链球菌感染患儿的样本痰液和脓液等标本接种于哥伦比亚血琼脂平板置35 ℃含5% CO2的孵育箱中培养24～48 h；血液标本经BACTEC FX 全自动血培养仪（美国BD 公司）肉汤增菌阳性报警后接种于哥伦比亚血琼脂平板置35 ℃含5% CO2的孵育箱中培养24～48 h。观察中间凹陷的单个菌落，涂片革兰染色，镜检可见革兰阳性球菌，呈矛尖状，尖端朝外，宽端相对，成双排列，无芽孢，有荚膜，疑为肺炎链球菌的菌株，随后进行奥普托欣敏感试验，37 ℃5% CO2孵育18～24 h 观察结果，抑菌圈＞14 mm 为敏感，初步判断其为肺炎链球菌。利用基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱仪（德国Bruker 公司）对其进行进一步菌种鉴定，大肠埃希菌ATCC25922 为仪器的校准株，综合以上结果鉴定为肺炎链球菌共107 株（同一例患儿同一部位的重复菌株不予统计），保存于-80 ℃冰箱，等检测前取出，37 ℃5% CO2孵育18 h 后进行后续血清型鉴定实验。本研究经衢州市人民医院医学伦理委员会审查通过（批件号：衢州市人民医院伦审2022研第059号）。

1.2 肺炎链球菌血清型分型鉴定 通过乳胶凝集试验和荚膜肿胀试验对待测肺炎链球菌进行血清型分型鉴定。乳胶凝集试验试剂和荚膜特异性抗血清SSI Diagnostica 购自丹麦研究所Statens Serum Institute。首先分别取5 μL 含有肺炎链球菌不同血清型抗原的乳胶悬液试剂到反应板上，加入5 μL 过夜培养的菌液，混匀，5～10 s 内观察凝集反应，根据凝集情况判断阳性反应，并通过血清型棋盘分组法判断所测肺炎链球菌的血清型或组。而后通过乳胶凝集试验确定待测肺炎链球菌的血清型或组后，将待检细菌混悬液与血清和亚甲基蓝混合等待5 min，在100 倍油镜下观察结果。如果荚膜显著肿大，菌体周围有一无色而较宽的环状物时，判定为荚膜肿胀试验阳性，随后根据肺炎链球菌血清型抗原反应结果标准判读待测菌株的血清型及其亚型。

1.3 统计学处理 采用Graphpad 9.0 统计软件。计数资料以例（%）表示，组间比较采用χ2检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患儿的一般资料及临床特征 107 例肺炎链球菌阳性患儿的一般资料见表1。患儿中男性占比51.4%；年龄2 个月～15 岁，其中≤1 岁患儿占比最高，为48.6%，其次是＞1～≤5 岁儿童占比41.1%，＞5 岁的肺炎链球菌阳性患儿仅占总数的10.3%。临床诊断以呼吸道疾病为主，其中诊断为支气管肺炎的患儿占68.2%，其次是支气管炎和上呼吸道感染，分别占10.3%和8.4%。标本来源以痰液标本为主，共100 例（占93.5%），其余分别为血液标本4 例（占3.7%），脓液标本3 例（占2.8%）。

表1 肺炎链球菌阳性患儿临床特征

2.2 肺炎链球菌血清型分布情况 107 株肺炎链球菌菌株除2 株不能明确分型外，共鉴定出21 种血清型，排名前5 位的血清型为19F（31 株，占29.0%），其次为6B（16 株，占15.0%）、14（9 株，占8.4%）、19A（8 株，占7.5%），3（5 株，占4.7%），见图1。7 价PCV（PCV7）、PCV13 和PCV20 的血清型覆盖率分别为56.1%（60/107）、71.0%（76/107）、78.5%（84/107）。PCV13 疫苗包含的4、9V、18C、1、5 和7F 血清型未有发现。另外，有21 株（19.6%）肺炎链球菌属于非疫苗血清型，其中血清型15A 分离出4 株，占比最大；另外还有6C、16F、23A、7C、13、20、34、10B、15C、35B 等型别。肺炎链球菌的各血清型在3 组不同年龄患儿中（≤1 岁、＞1～≤5岁和＞5 岁），PCV7 的血清型覆盖率分别为53.8%、61.4%和45.5%，PCV13 的血清型覆盖率分别为71.2%、68.2%和81.8%，PCV20 的血清型覆盖率分别为78.8%、75.0%和90.9%。非疫苗血清型在3 组不同年龄患儿分离菌株的占比分别为17.3%、25.0%和9.1%。

图1 肺炎链球菌血清型分布情况图（A：PCV7、PCV13 和PCV20 覆盖血清型肺炎链球菌在不同年龄组患儿中的分离情况；B：非疫苗血清型肺炎链球菌血清型分布情况；C：PCV 及非疫苗血清型菌株分离率，PCV13 增加和PCV20 增加分别代表这两种疫苗相较PCV7 增加的覆盖血清型所占比例）

2.3 不同疾病患儿肺炎链球菌血清型分布情况 107株肺炎链球菌分离自13 种临床疾病患儿，其中占比最高为支气管肺炎（68.2%，73/107），其次为支气管炎（10.3%，11/107），然后是上呼吸道感染（8.4%，9/107），见图2。肺炎患儿分离菌株中居前5 的血清型为19F、6B、14、19A 和15A，而引起支气管炎和上呼吸道感染主要是19F、6B 和14。其中分离自上呼吸道感染患儿的菌株中有4 株肺炎链球菌从血液标本中获得，血清型分别为6B 和14 各2 株。由于本研究收集的所有肺炎链球菌中引起儿童支气管肺炎的占比最大，因此，为评估PCV 对该类疾病的保护力，对PCV7、PCV13 和PCV20 覆盖血清型肺炎链球菌引起支气管肺炎和非该类疫苗覆盖血清型肺炎链球菌引起支气管肺炎病例数进行分析，结果表明，PCV7 覆盖血清型与非PCV7 血清型差异无统计学意义（χ2=0.564，P=0.453）；但PCV13 覆盖血清型与非PCV13 血清型和PCV20 覆盖血清型与非PCV20 血清型引起肺炎病例数比较差异均有统计学意义（χ2=6.957、9.974，P=0.008、0.002）。

图2 儿童分离肺炎链球菌不同血清型与疾病相关分布图

3 讨论

肺炎链球菌是引起幼儿各种感染性疾病最常见的病原菌，同时也是人体鼻咽部常见的定植菌，当机体抵抗力减弱的时候，肺炎链球菌便可能入侵机体引发感染，比如中耳炎、上呼吸道感染、肺炎和脑膜炎。据WHO 估计，每年约有70～100 万儿童死于PD，其中大多数为发展中国家儿童，包括中国[4-5]。PD 已经成为严重的公共卫生问题，然而自从PCV 问世以来，PD 在全民接种该疫苗的国家得到了有效控制，因此，2008年PD 被WHO 列为需“极高度优先”使用疫苗预防的疾病[6]。2021 年约翰霍普金斯大学彭博公共卫生学院统计数据显示，虽然目前中国儿童存活率已大大提高，但每年因PD 死亡的儿童人数仍有数千人[7]，而接种PCV 作为预防PD 的最佳干预措施在中国并未进入国家计划疫苗清单，自费接种费用较高，疫苗覆盖率不高。PCV 主要针对一些高毒力的流行血清型设计，因此评估肺炎链球菌血清型分布以及PCV 对我国儿童PD 的保护力将有益于推动肺炎链球菌疫苗接种和指导我国疫苗的研发。另外，我国各地区流行肺炎链球菌血清型有很大差异，且衢州地区目前无对应的肺炎链球菌分布和PD 监测数据，故本研究首次对衢州地区儿童患者分离肺炎链球菌血清型和相关PD 流行情况进行了全面分析，以期指导该地区的疫苗接种策略和促进PD 防控。

本研究发现，在过去2 年中，本中心引起16 岁以下儿童感染性疾病的主要流行肺炎链球菌血清型为19F、6B、14、19A 和3。Lyu 等[8]研究报道2006—2016 年中国肺炎链球菌的主要流行血清型为19F、19A、23F、14 和6B。同时，同一时段的一项Meta 研究表明中国儿童肺炎链球菌血清型以19F、19A、14、6B 和23F 为主[9]。这与本研究结果略有不同，区别在血清型19A作为PCV13 新增覆盖血清型在本中心流行排名中并非前3，这可能与近年来PCV13 的接种情况与过去10年相比有所提高相关，更说明长期监测肺炎链球菌血清型流行情况的必要性。另外，一项2020 年以前的研究发现引起儿童IPD 的肺炎链球菌血清型主要为19A、19F、14、23F 和6B[10]。虽然在本研究中仅有4 株肺炎链球菌来自血液标本，但它们的血清型仍然为6B和14，说明引起衢州市儿童IPD 的主要血清型与全国流行趋势一致。值得注意的是，血清型3 在本研究中排在血清型的前5，这与其他地区的研究结果不同[11]，作为另一个在PCV13 中新增的重要致病血清型，其疫苗应答效果不如19A，该结果也与其他相关报道一致[12]，提示需要在未来的PD 防控和疫苗设计中对该血清型有进一步针对性的措施。

本研究中107 株肺炎链球菌分离自2 个月～15 岁的儿童，52 株分离自1 岁以下患儿，占48.6%；96 株分离自5 岁以下患儿，占89.7%。这与WHO 和中华预防医学会相关专家共识符合，提示年龄＜2 岁儿童为肺炎链球菌感染的易感人群，其感染PD 的可能性远高于其他年龄段人群[13-14]。针对该易感人群，PCV 的保护就显得尤为重要，本研究表明，衢州地区PCV7 在2岁以下患儿中的血清型覆盖率为53.8%，而PCV13 则可以覆盖71.2%的2 岁以下患儿中分离到的致病性肺炎链球菌血清型，PCV20 的覆盖率更达到了78.8%。现阶段衢州地区可供自费接种的是PCV13，根据以上结果，相比2015 年以前的PCV7，说明PCV13 可以大大提高对该地区PD 易感儿童的保护。虽然PCV20 相比PCV13 仅有不到10%的血清型覆盖率提高，但PCV20新增血清型15B 在本研究中也导致3 例肺炎，因此在未来进一步推广PCV20 的接种也是非常必要的。另外，值得注意的是非疫苗血清型引起PD 的比例并不低（19.6%），其中还有2 株为无荚膜型肺炎链球菌，因此研究非血清型依赖性肺炎链球菌疫苗仍然是目前全球PD 防控需要努力的方向。

本研究肺炎链球菌阳性患儿中的临床诊断以呼吸道疾病为主，其中肺炎链球菌感染支气管肺炎的患儿最多，占比68.2%，其次是支气管炎和上呼吸道感染。针对该主要肺炎链球菌感染性疾病，笔者进一步的分析表明，支气管肺炎患儿中分离得到居前3 的血清型为19F、6B 和14，与其他地区肺炎链球菌导致儿童肺炎的优势血清型比较，如上海（19F、6A 和19A）[11，15]和北京（19F、19A 和23F），19F 均为最常见血清型。血清型6B 和14 在支气管肺炎患儿中的流行与上述地区有所不同，但与一项浙江地区的研究结果类似[16]，说明引起肺炎的致病性肺炎链球菌血清型具有显著的地域流行性。随后，针对该研究中肺炎链球菌导致的主要感染性疾病支气管肺炎，进一步评估了不同PCV 对衢州地区儿童的保护情况。本研究结果表明，PCV7 的接种并不能显著降低儿童肺炎链球菌肺炎的数量，但PCV13 和PCV20 能显著提高对肺炎链球菌引起儿童支气管肺炎的保护。该结果的报道在衢州地区尚属首次，将为指导该地区肺炎链球菌疫苗接种提供理论依据。另需注意的是，本次血液标本中分离得到的4 株肺炎链球菌均分离自上呼吸道感染患儿，有研究表明无病灶血流感染也有较高的病死率（7.8%）[17]，故对初诊断为上呼吸道感染未累积肺部形成病灶的患儿，血液标本的检测及持续关注也是极为重要的，可以避免IPD 的漏诊和治疗延误。

综上所述，本研究首次对衢州地区儿童感染PD分离菌株血清型分布及相关感染性疾病进行了分析研究。结果表明，引起衢州地区儿童PD 的主要血清型为19F、6B、14、19A 和3，主要引起该地区儿童患支气管肺炎。PCV13 和PCV20 对该地区儿童感染肺炎链球菌支气管肺炎有显著保护力，在未来免疫该疾病中应积极推广，非血清型依赖性肺炎链球菌疫苗的研发仍有重要价值。针对首诊无肺炎症状的上呼吸道感染患者也应提高重视，避免IPD 的漏诊。本研究为全面了解衢州地区肺炎链球菌流行情况和有效防控PD提供了科学数据，更明确了建立PD 发病状况的监测系统，针对肺炎链球菌血清型分布和感染性疾病长期流行病学监测的重要性。