耐药结核病患者外周血中补体3的临床意义

徐锦 张腊红 刘晓婷 孟宪梅 姚心怡 许宁沁 陈兆军

结核病是由结核分枝杆菌引起的慢性感染性疾病[1]。根据《2023 全球结核病报告》显示，全球范围预估上一年度结核病新发病例为1 060 万，约130 万人死于结核[2]。耐药结核病包括单耐药结核病、多耐药结核病、耐多药结核病、准广泛耐药结核病、广泛耐药结核病以及利福平耐药结核病[3]。最新数据表明，全球耐多药/利福平耐药结核病的患者数量约为41 万，我国耐药结核病患者报告病例数大致是1.24万（总数预估为3 万多），仅有40%左右患者确诊，而其中得到有效治疗的耐药结核病患者约占80%[2]。耐药结核病数量的增加，对当前结核病防治工作带来了极大挑战。已有文献报道，耐药结核病与非耐药结核病患者有免疫反应的差异[4]。目前大多数文献报道集中在耐药和耐多药结核病患者的T 淋巴细胞表达水平方面[5-7]，但鲜有报道耐药结核病患者外周血指标表达情况的报道。因此，本研究检测了耐药结核病患者外周血中补体3（complement3，C3）、C4、IgA、IgM、IgG、转铁蛋白、总蛋白、白蛋白、球蛋白、白蛋白/球蛋白、纤维蛋白原（fibrinogen，Fib）及D-二聚体（D-dimer，D-D）的表达情况并进行分析，以期发现耐药结核病的特异性实验室指标。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2018 年1 月至2023 年6 月于杭州师范大学附属医院收治的386 例非耐药结核病患者，男207 例，女179 例，年龄18～78（52±22）岁；118 例耐药结核病患者，男66 例，女52 例，年龄18～79（46±20）岁；选取同期同院体检健康者76 名作为健康组，男35名，女41 名，年龄18～75（42±13）岁；各项体检指标及影像学检查均正常。3 组对象性别（χ2=2.370，P=0.379）和年龄（F=1.825，P=0.162）比较差异均无统计学意义。结核病的诊断标准依据肺结核诊断标准（WS 288-2017）和结核病分类标准（WS 196-2017）。非耐药结核病患者纳入标准：（1）低热、咳嗽、咳痰、咯血等明显的临床症状；（2）胸部X线或CT 检查考虑结核，且为初次治疗；（3）痰涂片抗酸杆菌阳性及痰结核分枝杆菌培养阳性；（4）结核分枝杆菌药敏试验未发现耐药现象。耐药结核病患者纳入标准：（1）有明显临床症状，胸部X线或CT 检查考虑结核；（2）痰结核分枝杆菌培养阳性；（3）结核分枝杆菌药敏试验结果表明,至少对1 种及以上一线抗结核药物耐药。所有对象均排除使用糖皮质激素等免疫抑制剂以及艾滋病、恶性肿瘤、糖尿病、血液系统疾病、非结核分枝杆菌感染的肺部疾病、妊娠或哺乳期妇女等。本研究经杭州师范大学附属医院医学伦理委员会审查通过[批准文号：2023（E2）-KS-059]，患者或家属均知情同意。

1.2 标本采集与检测方法 于清晨空腹抽取所有研究对象的外周静脉血2 管（枸橼酸钠抗凝管、含促凝剂管）各5 mL，3 000 r/min 离心10 min（离心半径15 cm）分离血浆或血清备用。血清检测C3、C4、IgA、IgM、IgG、转铁蛋白、总蛋白、白蛋白、球蛋白以及白蛋白/球蛋白，血浆检测Fib 及D-D。血清C3、C4 和IgA、IgM、IgG 及转铁蛋白的检测用免疫散射比浊法测定，使用贝克曼IMMAGE800 特定蛋白分析仪及配套试剂操作；血清总蛋白检测采用双缩脲法，白蛋白检测采用溴甲酚绿法，球蛋白及白蛋白/球蛋白检测采用计算法，使用贝克曼AU5800 全自动生化仪及配套试剂操作；血浆Fib 检测采用凝固法，血浆D-D 检测采用胶乳免疫比浊法，使用SYSMEX CS5100 全自动凝血分析仪及配套试剂操作。

1.3 统计学处理 采用SPSS 26.0 统计软件。正态分布的计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较用LSD-t检验；非正态分布计量资料则用M（P25，P75）表示，多组间比较采用非参数检验，组间比较用Kruskal-WallisH检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

结果表明，3 组对象C3、C4、IgA、IgG、转铁蛋白、Fib、D-D、总蛋白、白蛋白及白蛋白/球蛋白比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）；耐药组C3明显低于非耐药组和健康组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；非耐药组C4 高于耐药组，差异有统计学意义（P＜0.05）；非耐药组IgA、IgG 均高于健康组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；耐药组与非耐药组Fib、D-D 均高于健康组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；耐药组与非耐药组总蛋白、白蛋白、白蛋白/球蛋白及转铁蛋白均低于健康组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见表1。

表1 3组对象外周血指标结果的比较

3 讨论

结核分枝杆菌为兼性胞内寄生菌，寄生于宿主细胞内。结核分枝杆菌的各种免疫逃逸机制使之可以在宿主中长期生存繁殖[8]。结核病患者的细胞免疫和体液免疫功能均受到不同程度的损害[9]，机体自身的免疫水平与结核病进展也有着密切联系[10-13]。而耐药结核病相比于非耐药结核病其免疫系统受到更严重的损害[14-15]。

通过对耐药结核病和非耐药结核病患者外周血指标的检测发现，结核病患者（耐药/非耐药）与健康组相比，D-D 和Fib 升高，总蛋白、白蛋白、白球比、转铁蛋白下降；这说明耐药结核病和非耐药结核病患者有着基本相似的免疫反应：肝脏损伤（总蛋白、白蛋白、白蛋白/球蛋白及转铁蛋白下降），凝血指标异常（Fib、DD 升高）。在耐药结核组中C4 低于非耐药结核组，但与健康组比较差异无统计学意义；耐药结核组与非耐药结核组、健康组均有差异性的外周血指标只有C3。

C3 是补体系统中最重要的组成成分。补体系统属于体液免疫，是抵御病原菌的首要防线[16]，由丝氨酸蛋白酶级联反应组成，通过补体蛋白的连续裂解，最终导致膜攻击复合物的形成，其目的是清除和遏制感染，但是补体系统不平衡也会影响宿主细胞，使细菌持续存在并逃避免疫系统的清除[17-18]。补体受体（complement receptor，CR）协助结核分枝杆菌进入吞噬性巨噬细胞，并通过各种适应性防御在其胞内成功增殖从而导致疾病[19]。Wang 等[20]通过iTRAQ-2D LC-MS/MS 技术联合Solexa 测序发现耐多药肺结核和非耐药肺结核患者组间有50 多种差异表达蛋白大多有补体途径参与。有研究实验表明结核分枝杆菌生物膜修饰了其细胞壁碳水化合物使补体沉积减少，即补体系统活化减少[21]。在结核感染中补体具有至关重要的作用[22]。补体系统中C3 为参与增强单核巨噬细胞对结核分枝杆菌的黏附和摄取人血清中的主要成分，并且能够调理结核分枝杆菌表面，通过CR1 和CR3 被巨噬细胞识别[23]。Naranjo 等[24]对野猪和牛分枝杆菌之间分子相互作用的表征表明，编码补体成分C3 和其他先天性及适应性免疫反应蛋白的基因在淋巴结和扁桃体中的上调与对天然分枝杆菌感染的抗性相关。更高的C3 水平可能允许增加的调理吞噬作用和有效的细菌清除，同时干扰CR3 介导的分枝杆菌的声波和非声波吞噬作用[25]。有回顾性研究表明低水平的C3 在结核性脑膜炎感染中有较高的死亡率[26]。耐药结核病患者中较低的C3 水平，进一步说明耐药结核杆菌在感染宿主时，因补体系统功能严重紊乱不能很好的清除结核分枝杆菌，从而导致单核巨噬细胞对细菌的附着和吞噬能力减弱，病原菌清除受限，继而促进了病原菌在宿主的进一步生长。本研究结果发现C3 在耐药组中低于非耐药组和健康组，差异有统计学意义。这说明C3 在耐药结核病患者中表达水平的降低对于临床有一定应用价值，但是否能作为耐药结核病的特异性指标，有待于进一步深入研究探讨。

综上所述，外周血中C3 在耐药结核病患者中的表达差异，提示耐药结核病患者补体系统失衡，体液免疫功能受损。