细菌生物膜的耐受性、耐药性和治疗策略研究新进展

周铁丽 孙瑶

生物膜是嵌入细胞外聚合物基质（extracellular polymeric substances，EPS）中的微生物群落[1]，广泛存在于自然环境中[2]。微生物能够定植于人体，并在口腔、皮肤和肠道黏膜等部位聚集形成生物膜，对宿主的生理和健康产生重要的影响[3]。

微生物能够在生物或非生物的表面形成生物膜，引起全身各部位的感染，常见有血管内导管感染、假体关节感染和慢性伤口等，病原微生物在宿主体内形成生物膜会导致难以根除的复发性和慢性感染[4-5]。表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和肠杆菌科细菌是引起生物膜相关性感染最常见的微生物，其中葡萄球菌是留置医疗器械相关感染的最常见病原菌[6-7]。生物膜具有高度的耐受性和耐药性，使病原菌能够逃避人体免疫防御，并抵抗抗菌药物的清除作用，给临床抗感染治疗带来巨大挑战[8]。本文对细菌生物膜的耐受性、耐药性，以及治疗策略研究的新进展和前景作一述评，为深化生物膜感染治疗策略的研究和应用提供参考。

1 生物膜的组成和特性

生物膜是附着在生物或非生物表面上，被以多糖、蛋白质和细胞外DNA（extracellular DNA，eDNA）为主要成分的EPS 包裹的三维微生物群落[9]。经典的表面附着生物膜形成是一个循环的过程，以5 个阶段渐进性的方式发生，包括可逆附着、不可逆附着、生物膜成熟Ⅰ期、成熟Ⅱ期和分散[10]。浮游细菌最初通过细菌附属结构（如菌毛和鞭毛）附着于表面；随后进入不可逆附着阶段，伴随着鞭毛反转速率的降低、鞭毛基因表达的减少和生物膜基质成分的产生，附着的细胞开始表现出药物耐受性。生物膜成熟阶段的特征是出现几个细胞的细胞簇，并嵌入生物膜基质中（成熟Ⅰ期），随后完全成熟为微菌落（成熟Ⅱ期），最后是扩散阶段。细菌生物膜形成各种酶，降解细胞外多糖的稳定性，使得位于生物膜表面的细菌细胞释放并在新表面上定植，从而导致感染的扩散[10]。生物膜形成过程中，从浮游生长到生物膜生长的转变，受到了由第二信使环二鸟苷酸（c-di-GMP）协调的生理、代谢和表型变化的调控。高水平的c-di-GMP 诱导生物膜形成，而低水平的c-di-GMP 导致生物膜解散[11]。

近年来，非附着生物膜聚集体相关研究受到广泛关注。研究显示微生物聚集体在自然环境和感染中普遍存在[12]。聚集体引起的感染以慢性感染为主，例如囊性纤维化相关感染和慢性伤口感染等[13]，也见于急性感染中[14]。非附着聚集体胞外基质的成分与表面附着生物膜高度相似，并且与表面附着的生物膜类似，与聚集体相比浮游细菌表现出更高的抗菌药物耐受性和免疫逃避能力[15]。近年来，对非附着生物膜聚集体的关注日益增加，聚集体的形成机制、耐药机制及其感染性疾病机制等尚待进一步阐明。

2 生物膜的耐受性和耐药性

2.1 生物膜对抗菌药物的耐受性 抗菌药物的耐受性是指细菌在致命抗菌药物浓度下的短暂存活能力，这可能是由于细菌减缓了基本的生存过程。生物膜与游离细胞相比需更高浓度和更长时间的抗菌药物治疗[16]。生物膜的耐药性可高于浮游细菌10～1 000倍[17]。当前研究表明，多种机制参与了调控生物膜的高度耐药性。

2.1.1 基质 抗菌药物与生物膜基质的相互作用受到两者物理性质的影响，包括抗菌药物的分子大小和表面电荷。妥布霉素等阳离子抗菌药物能与生物膜基质中带阴离子的eDNA 等成分发生反应，从而降低了抗菌药物分子在生物膜中的扩散速率[18]，由于抗菌药物在生物膜中扩散减慢，细菌细胞有更充分的时间来启动适应性应激反应，进而增加耐受性[3]。据报道，万古霉素、苯唑西林、头孢噻肟和德拉沙星在葡萄球菌生物膜基质中的渗透性受限，而环丙沙星和阿米卡星的渗透性受基质影响较小[19]。铜绿假单胞菌过度产生藻酸盐的黏液型菌株形成的生物膜与非黏液型菌株形成的生物膜相比，耐受性更强[20]。此外，基质中所储存的抗菌药物修饰酶[21]或含有的丝状噬菌体[22]等也可能减缓抗菌药物的扩散。

2.1.2 生物膜的异质性 生物膜由气液界面上的活跃、快速生长的细胞亚群和深层的代谢不活跃、生长缓慢或不生长的细胞亚群构成，与养分和氧气的分布相对应。同时，宿主免疫反应造成的微环境，可能加剧细菌的无氧生存环境[23]。生长缓慢和缺氧可导致生物膜深层细菌对抗菌药物的敏感性降低。研究显示，低氧水平能够降低妥布霉素和环丙沙星的杀菌作用[24]，而低代谢活性的细菌可能导致抗菌药物靶标产生减少和靶标活性降低。根据抗菌药物的作用机制，其活性受到细菌生长速度和生理状态不同程度的影响。β-内酰胺类药物和四环素类分别作用于细胞壁和核糖体，对生长缓慢细胞效果较差；而庆大霉素、环丙沙星和利福平等对非生长细胞表现出较好的作用[3]。

2.1.3 适应性应激反应 生物膜中营养、氧气缺乏和抗菌药物的存在造成应激条件，触发适应性应激反应，主要包括诱导SOS 反应、严紧反应和由RpoS 因子调控导致的一般应激反应，进而介导生物膜对抗菌药物的耐受性。营养限制和抗菌药物暴露，可以通过活性氧的形成诱导DNA 损伤[25]，SOS 反应是对DNA 损伤的应激反应，可通过诱变和基因组重排诱导生物膜形成和抗菌药物耐药性，在慢性细菌感染中发挥关键作用[26]。严紧反应是一种高度保守的信号通路，通过激活鸟苷3'，5'-双焦磷酸（ppGpp）产生，可确保细菌在营养限制条件下存活[27]。有研究显示，严紧反应在生物膜中被激活，能促进其对抗菌药物产生耐受性，例如铜绿假单胞菌可以通过激活严紧反应表达来促进对环丙沙星和庆大霉素产生耐受性[28]。RpoS 是一种全局调控因子，在生长静止期控制多种基因，能够促进细菌生物膜形成以及增强其对抗菌药物的耐受性[29]。

2.1.4 持留细胞 持留细胞是一种不生长且代谢不活跃的细胞，可发生于抗菌药物治疗、营养物质匮乏和生物膜状态下，能够逃避宿主免疫系统攻击和抗菌药物杀伤，是导致生物膜感染复发的重要原因[28]。尽管目前对持久细胞形成机制尚未达成共识，但广泛的研究为深入了解持留细胞的形成和复苏治疗提供了可能。此外，小菌落变体（small colony variants，SCVs）似乎与细菌在宿主细胞和组织中的持续存在有关，包括慢性感染中分离的金黄色葡萄球菌SCVs[30]和医疗器械相关性感染中分离的凝固酶阴性葡萄球菌SCVs[31]等。

总的来说，生物膜对抗菌药物耐受性是一个动态、受多种因素影响的过程。在高度多样的生物膜感染中，不同的耐受机制包括基质组成、异质性的代谢活性、氧梯度以及对各种应激的适应性反应的激活。这些机制的作用因抗菌药物治疗、生物膜感染的类型和位置而异。

2.2 生物膜对免疫系统的耐受性 生物膜可通过阻碍细菌识别或减少炎症反应使细菌能够逃避人类宿主的免疫系统[32]。与单个细胞相比，生物膜群落体积增大可产生对白细胞吞噬作用的抵抗力[33]。EPS 可以通过在细菌表面屏蔽病原体相关分子模式来引发免疫逃避。例如，金黄色葡萄球菌通过凝固酶表达将纤维蛋白掺入其EPS 中，从而保护生物膜细菌免受免疫识别[34]。生物膜形成通常被认为是细菌对抗环境威胁的一种防御机制，包括抗菌药物、噬菌体和人体免疫系统的白细胞。然而，近年来Vidakovic 等[35]研究发现霍乱弧菌在真核细胞表面形成生物膜包裹免疫细胞，以c-di-GMP 依赖的方式分泌溶血素来杀死免疫细胞，提示生物膜的形成不仅是一种保护特征，而且是一种侵袭特征。

2.3 生物膜对抗菌药物的耐药性 抗菌药物耐药性通常由遗传学改变引起，如细菌耐药基因突变或通过水平基因转移（horizontal gene transfer，HGT）获得的抗菌药物耐药基因等。

2.3.1 生物膜中耐药基因突变 生物膜由于营养物质扩散受损以及表面细菌层的代谢活跃消耗氧气，呈现出空间结构异质的环境。生物膜内微生物细胞的特定生理状态和抗菌药物浓度梯度可以显著促进耐药性的发展[36]。此外，适应性应激反应可能提高细菌耐药基因突变率促进耐药的进化。例如，铜绿假单胞菌生物膜中的内源氧化应激已被证明可以通过DNA 双链断裂的诱变修复来促进诱变[37]。此外，研究表明生物膜中抗菌药物耐药性的进化速度比浮游细菌的进化速度更快。与暴露于相同亚抑菌药物浓度的浮游培养物相比，铜绿假单胞菌生物膜的生长模式促进了低水平突变抗性的发展[36，38]。然而，生物膜中的耐药机制类型和动态取决于不同抗菌药物施加的选择压力，以及由特定突变引起的适应成本[39]。

2.3.2 生物膜中的耐药基因水平转移 抗菌药物耐药基因（antibiotic resistance genes，ARGs）可以通过HGT迅速传递，生物膜中的细胞相对接近且滞留时间较长，促进了核酸的交换和再循环，HGT 的发生频率比在浮游培养物中更为常见[40]。HGT 通过直接细胞间接触（接合）、接受DNA 的细胞摄取胞外DNA（转化）或噬菌体介导的DNA 转移（转导）等方式，将DNA 从供体细胞传递到受体细胞[40]。在生物膜中，缺氧或亚抑制抗菌药物浓度的刺激效应能够影响质粒的传递速率[41-42]。此外，与浮游细菌相比，生物膜中接合质粒的拷贝数增加，可能促进AGRs 传播[43]。据文献报道，金黄色葡萄球菌生物膜中接合质粒的转移率比浮游培养物中的接合质粒转移率高16 000 倍[44]。

膜囊泡可以携带不同类型的遗传物质，如质粒DNA、染色体DNA、噬菌体DNA 或RNA[45]。DNA 封装于膜囊泡中可以防止核酸外切酶的降解、冷冻失活和热降解[46]。生物膜基质中积累的膜囊泡可以在细菌之间转移ARGs 或质粒，促进HGT[47]。目前，有关膜囊泡介导耐药基因转移研究主要在浮游细菌方面，其在生物膜中ARGs 转移中的作用仍需进一步开展。

3 生物膜的治疗策略

生物膜由微生物和不同周围组织基质组成，可视为一种独立于血流和间质液的药代动力学微环境，因此，它们表现出与周围组织不同的抗菌药物药代动力学，抗菌药物途径较难通过全身给药到达选择，合适的局部用药十分关键，迫切需要在临床上开发针对生物膜的靶向药物[48]。下文对现有抗生物膜药物及对潜在的抗菌治疗策略的展望。

3.1 常规抗生物膜药物 生物膜通过前文提到的多种机制增强对常规抗菌药物的耐药性，使抗菌药物对其的治疗效果不佳。针对具有不同代谢活性的细菌细胞，将不同种类抗菌药物进行联合用药，可能是对抗生物膜的有效手段。例如，利福平与环丙沙星、利奈唑胺、达托霉素或替加环素联合用药能够有效清除屎肠球菌生物膜[49]。此外，研究显示植物来源的非抗菌药物香芹酚能够恢复耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生物膜对β-内酰胺类药物的敏感性[50]。此外，研究显示联合用药能有效预防植入物上生物膜的形成。据报道米诺环素和利福平联合可以有效预防心脏植入电生理装置生物膜相关性感染[51]。

3.2 抗菌肽（antimicrobial peptide，AMP） AMP 是一类小分子肽，通常由12～50 个氨基酸残基组成[52]。与传统抗菌药物相比，AMP 具有耐药性出现较慢的优势，同时具备广谱抗生物膜活性和有利调节宿主免疫反应的能力[53]。研究报道AMP bac（1-35）能够破坏高黏液表型肺炎克雷伯菌形成的生物膜，暴露细菌并发挥高效抗菌活性[54]。此外，天然或合成的AMP 已被证明可防止微生物在表面定植，杀死生物膜中的细菌并破坏其结构，在预防医疗器械相关感染方面具有潜力。例如，红辣椒中提取的AMP 表现出抗黏附特性，能够预防表皮葡萄球菌生物膜的形成[55]。AMP 具有多种有效的抗生物膜机制，有望在临床中应用以清除生物膜，进一步的体内研究将有助于更全面地了解其在复杂宿主环境中的活性和稳定性。

3.3 纳米粒子 纳米材料具有独特的理化性质、较强的杀菌活性和特定的机制，可以通过物理损伤、氧化应激、热损伤等方式抑制细菌生物膜的生长，在细菌性疾病的治疗、提高抗菌药物的治疗效果和克服细菌耐药性上显示出广阔的前景。研究人员通过将纳米颗粒涂覆植入物材料表面，可以防止生物膜的形成[56]。生物膜的复杂防御系统使得抗菌药物和新型小分子等递送存在效率低下或失活等问题。纳米技术作为一种新策略，可以靶向生物膜或其内部成分，增强药物的渗透性，使其保持较高的作用浓度[57]。此外，许多金属纳米材料，如磁性氧化铁纳米颗粒、银纳米颗粒和金纳米颗粒等都显示出良好的抗生物膜活性。近年来，多种类型有机纳米颗粒显示出显著抗生物膜的活性和良好的生物相容性[58]，已成为抗生物膜研究的热点。

3.4 噬菌体 噬菌体能够靶向杀菌，并具有较高的生物安全性，被认为是治疗细菌感染的理想候选手段之一。尽管生物膜可以保护细菌免受恶劣的环境影响和噬菌体捕食，但噬菌体可以编码解聚酶等EPS 降解酶，以对抗生物膜[59]。研究显示噬菌体对于金黄色葡萄球菌生物膜引起的假体周围关节感染具有很好的抗菌活性[59]。此外，有研究采用噬菌体和抗菌药物联合用药，发现噬菌体联合环丙沙星能够有效清除铜绿假单胞菌生物膜[60]。噬菌体的使用也存在一定的局限性，例如细菌通过溶原性噬菌体将耐药基因在整个生物膜群落里传播，提高耐药风险[61]。噬菌体在清除生物膜感染中展现的出色能力，人们认为噬菌体疗法在细菌感染的治疗中仍具有巨大的潜力。

3.5 其他抗生物膜策略 为了对抗生物膜的耐药性，非抗菌药物的抗生物膜活性开发是近年来研究热点，包括群体感应抑制剂，例如mBTL 可在体内外抑制铜绿假单胞菌的群体感应受体LasR 和RhlR 的合成，进而抑制生物膜的形成[62]；EPS 降解酶和其他酶类，如小分子抑制胞外多糖修饰酶能够阻断胞外多糖Pel 依赖的生物膜形成[63]；c-di-GMP 生物合成抑制剂，c-di-GMP 在绝大多数细菌的生物膜生命周期中起着关键作用，研究发现一氧化氮能够通过调节c-di-GMP 浓度促进生物膜的分散[64]；其他还包括生物膜靶向抗体[65]、外排泵抑制剂[66]和来源于动植物的天然产物[67]等。上述抗生物膜成分通过不同的机制选择性地发挥作用，对抗生物膜相关的难治性感染。

4 结论和展望

细菌生物膜与人类健康密切相关，生物膜相关人类感染性疾病表现出较高的耐受性和耐药性，迫切需要开发新型高效的生物膜预防和治疗策略。本文对生物膜的形成和特征，生物膜对宿主免疫和抗菌药物的耐受性和耐药机制以及对目前治疗策略研究新进展进行阐述。然而，生物膜的复杂性使其治疗和清除尤为困难。在未来，有必要利用多组学和生物信息学技术来分析各种微生物生物膜的形成机制和开发生物膜抑制剂，预防生物膜的形成；同时通过跨学科的合作开发新型医疗植入物表面材料，防止生物膜的定植和提高清除能力；鉴于生物膜中特殊的药代动力学，有必要进一步优化用药策略，建立局部生物膜治疗药物递送系统，以提高对生物膜的清除效能，并避免对周围组织的不良反应。此外，需要进一步优化体内外生物膜研究模型，提高体外研究到体内转化应用的能力，以期通过以上方法能在未来能够更有力地克服生物膜感染的挑战。

（本文由浙江省医学会推荐）