基于全外显子组测序技术下早发性卵巢功能不全致病基因研究进展

董 萌, 谭季春

中国医科大学附属盛京医院,辽宁 沈阳 110022

早发性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency,POI)定义为女性在40岁之前卵巢性激素水平分泌不足导致卵巢功能减退和更年期提前[1-2]。目前,全球临床公认的POI诊断标准包括:40岁之前出现连续4个月以上的闭经或月经稀发,间隔1个月以上连续两次血清促卵泡激素水平>25 IU/L[3]。40岁以下女性POI发病率约为1.0%,30岁以下女性发病率约为0.1%[4]。流行病学研究发现,POI的发病率与年龄、种族密切相关[4]。POI患者短期表现为潮热、睡眠障碍、阴道干燥、情绪障碍等更年期症状,长期会出现心血管疾病、阿尔茨海默病、骨质疏松等[3]。POI为临床异质性疾病,发病机制复杂,个体差异较大,可由卵泡早期衰竭、成熟受阻或卵母细胞池破坏及卵巢抵抗等潜在机制引起[5]。POI病因可分为遗传性因素(染色体异常、遗传多态性、单基因突变)、自身免疫和代谢紊乱、感染、环境因素及医源性程序等[6]。约50%～90%的POI患者是特发性的,其中,10%～30%是家族性的[7-8]。

对POI致病基因的探寻一直是生殖医学领域的热点和难点。在过去的几十年里,很多POI候选基因被发现,但很少被纳入致病功能验证。在大型POI谱系中采用全外显子组测序(whole exome sequencing,WES)技术可发现新的致病原因并提出候选病因,虽然致病基因名单在不断扩大,但这只是POI遗传学的冰山一角[9]。陈子江院士团队对1 030例POI患者进行了WES,在59个已知的POI致病基因中检测到了195个致病或可能致病的突变,占所有患者的18.7%,通过关联分析进一步将POI患者与5 000例无POI者进行比较,确定了另外20个与POI相关的基因,并发现这些基因具有显著的功能突变,参与了卵巢的发育及功能,包括促性腺激素生成(LGR4、PRDM1)、减数分裂(CPEB1、KASH5、MCMDC2、MEIOSIN、NUP43、RFWD3、SHOC1、SLX4、STRA8)、卵泡发生和排卵(ALOX12、BMP6、H1-8、HMMR、HSD17B1、MST1R、PPM1B、ZAR1、ZP3),累积起来,已知POI致病基因和新型POI相关基因的致病性和可能致病性变异共导致242例POI发生,占所有患者的23.5%[10]。另一项来自英国的研究对英国生物样本库中的104 733名女性的外显子组序列数据进行分析发现,在生殖健康的女性中存在99.9%的蛋白截短突变,对于绝大多数女性来说,POI不是由常染色体显性变异引起的,无论是以前报道的基因还是目前临床上的候选基因[8]。

近年来,采用WES技术在大型POI家系中发现了很多与POI相关的致病基因,主要包括与X染色体异常相关的基因,已知的POI候选基因,与DNA损伤修复、同源重组、减数分裂相关的POI致病基因,以及与mRNA转录、翻译相关的基因。

1 与X染色体异常相关的基因

X染色体异常包括X染色体的重复、缺失及易位。特纳综合征为一条X染色体的全部或部分缺失,导致先天性卵巢功能衰竭[11]。X三体,如47XXX基因型,与促性腺功能低下的卵巢功能不全相关[12]。另一种导致POI先天性异常的是脆性X型智力迟钝基因,该基因中存在CGG重复序列(大约55～199个重复序列),其还与男性发生Martin-Bell综合征相关[13]。

2 已知的POI候选基因

2.1 卵泡刺激素受体 促卵泡激素通过作用于促卵泡刺激素受体,在促进卵泡生长、调节卵巢功能等方面起着至关重要的作用[14]。卵泡刺激素受体多态性可能引起卵巢功能下降,从而导致POI的发生。rs6165和rs6166多态性是卵泡刺激素受体中常见的两种错义突变,这两个位点的G到A翻转导致相应氨基酸序列的氨基酸残基置换,因此,这两种多态性可能影响促卵泡激素与卵泡刺激素受体的结合[15]。Meta分析提示rs6166多态性与POI风险显著相关[16]。

2.2 转录因子SOHLH2 在中国人群POI患者中发现了2个SOHLH2错义突变(p.Ser317Phe和p.Glu376Lys),其会改变SOHLH1蛋白作为转录因子的活性,可能与microRNA hsa-miR-888-5p产生新的结合位点[17]。

3 与DNA损伤修复、同源重组、减数分裂相关的POI致病基因

3.1 基质抗原3 基质抗原3基因位于7号染色体q22区,可编码内聚蛋白亚基,在减数分裂过程中起着关键作用,调节内聚蛋白环和突触复合体的组装,参与染色体的排列和纺锤体的装配。在小鼠中敲除基质抗原3后,小鼠不孕,卵巢发育不良,卵母细胞减数分裂停滞,着丝粒染色体内聚缺陷[18]。基于家系的研究中已经发现了多种基质抗原3蛋白的截短突变,这种突变呈现隐形遗传模式,女性具有原发性闭经和性腺发育不良等表型[19-21]。基质抗原3突变还可引起男性非梗阻性无精子症的发生[22]。

3.2 染色体微小维持体8和染色体微小维持体9 染色体微小维持体8和染色体微小维持体9为常染色体基因,编码DNA解旋酶,在DNA双链断裂修复中起着重要的作用[23]。在POI家族中可检测到染色体微小维持体8和染色体微小维持体9的基因突变,表现为DNA损伤处募集和染色体断裂修复缺陷,其突变患者表现为性腺功能减退及闭经[24]。染色体微小维持体8和染色体微小维持体9突变的遗传方式为常染色体隐性。在敲除染色体微小维持体8或染色体微小维持体9的小鼠中发现,雌鼠不孕,早期生殖细胞丢失,易患肿瘤性疾病,如肝细胞癌、卵巢肿瘤/增生等[25]。

3.3 突触复合体中心元件1 突触复合体中心元件1基因编码突触复合体的一个组成部分。突触复合体是一种减数分裂特异性结构,为同源染色体之间的重组提供了一个平台,对基因组的稳定性和配子的多样性至关重要[26]。突触复合体由中心元素突触复合体中心元件1、突触复合体中心元件2、突触复合体中心元件3、TEX12、C14ORF39、侧元SYCP2和SYCP3、横向丝SYCP1组成[27]。在小鼠中敲除突触复合体中心元件1会导致减数分裂阻滞和配子凋亡加速,从而引起雌性和雄性不育[28-31]。在家族性POI和非梗阻性无精子症患者中,突触复合体中心元件1、SYCP2同源物及C14ORF39的变异被发现,包括拷贝数突变及微缺失[29,32]。在一个以色列阿拉伯近亲家系中,在常染色体隐性遗传的原发性闭经女性中发现了突触复合体中心元件1蛋白截短纯合突变p.Q205*[28]。

3.4 C14orf39 C14orf39也是编码突触复合体中心元件的基因。Hou等[32]报道了散发性POI和非梗阻性无精子症患者中C14orf39的2个纯合突变,功能研究发现,C14orf39的变异显著加速了蛋白降解,影响突触复合体的组装和减数分裂。通过WES在不同种族人群的不育个体中发现了突触复合体编码基因C14orf39/SIX6OS1的3个纯合突变,包括巴基斯坦家庭中的1个移码突变(c.204_205del[p.His68Glnfs*2]),其中,2名男性患有非梗阻性无精子症、1名女性患有POI;2名无关系的中国男性非梗阻性无精子症患者中存在1个无义突变(c.9G>T[p.Glu320*])和1个剪接突变(c.1180-3C>G);C14orf39的截短突变保留了与突触复合体中心元件1的结合,但C14orf39和突触复合体中心元件1之间的复合物形成受损;携带C14orf39移码突变的家族男性在同源染色体之间表现出完全的失联,而携带无义或剪接突变的中国男性在同源染色体之间表现出不完全的突触[29]。

3.5 PSMC3IP PSMC3IP是引起POI和卵巢发育不良的常染色体隐性基因,其有9个外显子,编码一种核蛋白,该核蛋白在减数分裂重组中发挥作用,并作为核激素受体介导配体依赖性转录的辅助激活因子[33]。PSMC3IP蛋白可结合α/β-雌激素受体及糖皮质激素、甲状腺、雄激素、孕激素受体,并作为激素依赖性转录激活的辅助激活因子[34]。在也门的一个家系中发现了PSMC3IP的纯合突变,该家族女性被诊断为青春期延迟、原发性闭经及卵巢功能不全,男性被诊断为无精子症[35]。此外,在33例法国POI患者中也发现了PSMC3IP的突变[36]。

3.6 ATP依赖性DNA解旋酶同源物 ATP依赖性DNA解旋酶同源物编码在性腺中优先表达的DNA解旋酶,这是减数分裂过程中同源染色体间的同源重组和突触所必需的。ATP依赖性DNA解旋酶同源物敲除使小鼠不育,卵巢小,卵泡减少[37]。ATP依赖性DNA解旋酶同源物双等位基因突变可引起人类隐性POI,在中国散发性POI患者中也发现了不同的ATP依赖性DNA解旋酶同源物杂合突变[38]。ATP依赖性DNA解旋酶同源物错义突变(c.3G>A)在受影响的家庭成员中是杂合的,而在未受影响的家庭成员中不存在。生物信息学剪接预测工具显示,该突变极有可能对剪接位点功能产生强烈影响[39]。

3.7 CSB-PGBD3 融合基因CSB-PGBD3编码DNA修复蛋白。对4例POI患者进行WES并对432例散发患者进行Sanger测序,在融合基因CSB-PGBD3中发现了3个新的突变,功能研究表明,突变的CSB-PGBD3融合蛋白在DNA损伤的反应中受损,表现为受损部位的招募延迟或缺失,其主要作用为调节或参与DNA修复[40]。

3.8 MSH4和MSH5 MSH4和MSH5是DNA错配修复家族的成员,可形成异二聚体复合体,在减数分裂前期Ⅰ结合DNA链,稳定同源染色体之间的相互作用,在染色体突触和减数分裂重组中发挥着关键作用[41]。在一个哥伦比亚POI家族中,发现了MSH4的1个纯合剪接位点突变p.I743_K785del,其使MSH4失活[42]。在一个有2个患病兄弟姐妹的中国POI家系中,发现了1个位于MSH5 DNA结合域的纯合突变p.D487Y,该突变体在体外破坏了MSH5的DNA重组修复[43]。

4 与mRNA转录、翻译相关的基因

4.1 真核翻译起始因子4E核输入因子1 真核翻译起始因子4E核输入因子1(eukaryotic translation initiation factor 4E nuclear input factor 1,eIF4ENIF1)是一种细胞核质穿梭蛋白,富集于P小体中,用于运输真核翻译起始因子4E。此外,eIF4ENIF1可以竞争性地阻止真核翻译起始因子4E与真核翻译起始因子4G的有效结合,通过干扰两者之间的相互作用来调节核糖体延迟,从而减少蛋白质合成[44]。因此,eIF4ENIF1可以控制核糖体进入特定mRNA的5′帽结构并介导翻译抑制[45]。eIF4ENIF1对于小鼠卵母细胞核膜的破坏和减数分裂的恢复至关重要[46]。在一个法裔加拿大家族中,7例POI患者在eIF4ENIF1中具有杂合性过早终止密码子(Ser429*),而在未受影响的成员中不存在[47]。有学者在中国POI患者中也发现了eIF4ENIF1的突变[48-49]。

4.2 异核核糖核蛋白颗粒K同源性结构域家族RNA结合蛋白 异核核糖核蛋白颗粒K同源性结构域家族RNA结合蛋白含有1个KH结构域,该结构域可直接与单链RNA结合,并含有额外的保守QUA1和QUA2结构域,为RNA结合所必需[50]。其主要作用为参与信号转导、mRNA前剪接、mRNA翻译、细胞周期调节和凋亡等生物学过程[51]。敲除异核核糖核蛋白颗粒K同源性结构域家族RNA结合蛋白的雌鼠不孕,表现为性成熟延迟,次级和窦前卵泡数量显著减少[52]。在2例中国POI患者中发现了异核核糖核蛋白颗粒K同源性结构域家族RNA结合蛋白的杂合突变(c.4A>G,p.M154V),进一步对215例携带异核核糖核蛋白颗粒K同源性结构域家族RNA结合蛋白基因的特发性POI患者进行突变分析,发现了1个杂合突变(c.2C>T,p.P88L),但是未在400名健康对照女性中发现这两种突变[53]。

4.3 转录因子TP63 TP63在女性生殖系中保护基因组完整性[54]。在POI患者中发现了TP63的6个杂合突变,这些突变破坏了TAp63α蛋白C端的激活抑制结构域,导致突变蛋白的四聚体形成和组成性激活,突变蛋白通过增加体外诱导凋亡因子的表达而诱导细胞凋亡[55]。

5 未来展望

阐明POI的遗传和分子基础对POI的治疗至关重要,对POI患者的遗传咨询和生育指导发挥积极作用。随着测序技术的发展和POI样本库的扩大,越来越多的POI致病基因被发现。目前,已有相对大规模的POI队列研究报道,但是仍需要进行多中心的临床队列研究,增强国际间的合作,结合先证者的测序数据和功能验证等进一步筛查POI致病基因。识别有POI风险的个体也是临床医师面临的重要挑战,结合先进的测序技术和分析方法对POI的风险进行预测、常规诊断及早期干预具有重要意义。