人脐带间充质干细胞治疗早发性卵巢功能不全系统评价

刘贵悦, 杨金姬, 付 浩, 王 芳, 胡春秀

武装警察部队特色医学中心 军人生殖医学科,天津 300162

早发性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency,POI)被定义为女性40岁前卵巢功能过早衰竭,诊断标准为少经或闭经至少4个月,2次(间隔>4周)卵泡刺激素水平升高>25 IU/L,发病率约为1%～3%[1]。POI的病因复杂,与环境免疫、遗传、医源性因素有关,目前尚无明确有效的治疗策略[2]。近年来,随着再生医学的不断发展,越来越多的研究关注于干细胞在POI治疗中的应用及效果[3]。干细胞具有自我更新和再生功能,且具有创造再生微环境的能力,可能成为POI的新疗法[4]。一项非随机Ⅰ期临床试验结果显示,卵巢内移植干细胞治疗POI是有效、可行的[5]。间充质干细胞是一种具有较强免疫调节特性的多能成体干细胞,可抑制B细胞增殖,降低肥大细胞脱颗粒,抑制单核细胞成熟,且具有多向分化和自我修复潜能,并可通过旁分泌发挥抗氧化、抗炎症及抗凋亡等作用[6]。近年来,间充质干细胞在卵巢功能修复中的研究也越来越多,已有研究显示,间充质干细胞对卵巢功能具有良好的改善作用,可恢复性激素的正常分泌,增加卵泡数量[7]。间充质干细胞来源广泛,包括脐带、经血、骨髓、卵巢、羊膜、腹膜、胎盘、脂肪等,人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)由于无伦理学争议、来源广,而在再生医学中被广泛应用[8]。本研究旨在探讨hUC-MSCs对小鼠POI治疗效果的影响。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 检索策略 利用计算机检索主要的医学相关中英文数据库Embase、Clinical Trials、万方、the Cochrane Library、中国知网、Pubmed等。检索时间范围从建库至2023年6月。中文检索词和英文检索词包括人脐带间充质干细胞、干细胞、早发性卵巢功能不全、卵巢早衰、原发性卵巢功能不全、过早闭经、premature ovarian insufficiency、primary ovarian insufficiency、POI、premature menopause、premature ovarian failure、poor ovarian response ovarian dysfunction、stem cell、human umbilical cord mesenchymal stem cells、hUC-MSCs。另外,通过人工检索纳入研究中的参考文献,以进一步确定其他符合条件的实验研究。

1.2 纳入及排除标准 纳入标准:(1)研究类型。在国内外公开发表的随机动物研究实验。(2)研究对象。雌性小鼠POI动物模型。(3)干预措施。实验组小鼠POI动物模型接受hUC-MSCs治疗,对照组不接受治疗或接受生理盐水、PBS治疗。(4)结局指标。包括血清黄体生成素、抗苗勒管激素、雌激素、卵泡刺激素等激素水平,原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡、闭锁卵泡等各级卵泡计数情况,小鼠体质量,卵巢质量,发情周期,产仔数等。排除标准:(1)重复研究的动物实验。(2)无法获取原始数据或结局指标相关数据不完整的研究。(3)hUC-MSCs联合其他方法进行治疗或非hUC-MSCs治疗。(4)勘误或评论、会议摘要、荟萃分析、病例报道、信函、综述等。(5)非小鼠POI动物模型的实验研究。(6)实验研究以非中文或英文发表。

1.3 文献筛查及方法质量学 两名研究者分别根据上述检索词对医学数据库进行独立检索,阅读检索相关的文献,同时根据纳入和排除标准进行文献筛选及评估,最终纳入文献的相关实验数据分别由两名研究者独立提取,当意见存在分歧时则进一步通过讨论进行解决。提取的相关研究数据主要包括国家、出版时间、作者姓名、动物种类、实验组与对照组小鼠数量、小鼠周龄、小鼠建模诱导方法、干预措施等。

1.4 文献治疗评估 两名研究者分别独立使用SYRCLE的偏倚风险工具以评估动物研究的偏倚风险。SYRCLE的偏倚风险工具包括10个方面[分配隐藏、基线特征、盲法(动物饲养者与研究者)、随机序列生成、盲法(结果评价者)、动物安置随机化、随机化结果评估、选择性结果报告、不完整数据报告、其他偏倚来源],评估结果的高、低及不确定风险分别以“否”“是”“不确定”表示。

1.5 统计学方法 采用Cochrane协作网提供的Review Manager 5.4软件进行统计分析。连续资料用95%可信区间的加权均差或标准均差表示,二分类资料用95%可信区间的风险差或风险比表示。采用Q统计检验评价不同研究的异质性:I2≤50%为具有均匀性,I2>50%为非均匀性;当I2≤50%时采用固定效应模型,当I2>50%时采用随机效应模型。当有10项以上的研究具有相同的结局参数时,构建漏斗图来评估发表偏倚。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 文献筛选流程及结果 符合文献9篇[9-17]。筛选流程见图1。

图1 筛选流程

2.2 研究基本特征及质量评估 文献发表年份为2019-2023年;研究共纳入236只小鼠,其中,实验组118只,对照组118只。9项研究通过不同的方法进行POI造模,基本特征见表1,偏倚风险评价结果见表2。

表1 研究基本特征

表2 偏倚风险评价结果

2.3 Meta分析结果

2.3.1 血清雌激素水平 9篇文献纳入236只小鼠,其中,实验组118只,对照组118只。异质性分析结果表明存在异质性(χ2=1 406.75,I2=99%,P<0.01),采用随机效应模型得出,均差=22.05(95%可信区间7.37～36.74),P<0.01。即与对照组比较,实验组可提高血清雌激素水平。见图2。

图2 血清雌激素水平Meta分析

2.3.2 血清卵泡刺激素水平 9篇文献纳入236只小鼠,其中,实验组118只,对照组118只。异质性分析结果表明存在异质性(χ2=894.05,I2=99%,P<0.01),采用随机效应模型得出,均差=-2.77(95%可信区间-4.45～-1.10),P<0.01。即与对照组比较,实验组可降低血清卵泡刺激素水平。见图3。

图3 血清卵泡刺激素水平Meta分析

2.3.3 血清抗苗勒管激素水平 4篇文献纳入82只小鼠,其中,实验组41只,对照组41只。异质性分析结果表明存在异质性(χ2=79.65,I2=96%,P<0.01),采用随机效应模型得出,均差=166.12(95%可信区间48.29～283.95),P<0.01。即与对照组比较,实验组可提高血清抗苗勒管激素水平。见图4。

图4 血清抗苗勒管激素水平Meta分析

2.3.4 血清黄体生成素水平 2篇文献纳入40只小鼠,其中,实验组20只,对照组20只。异质性分析结果表明存在异质性(χ2=6.93,I2=86%,P<0.01),采用随机效应模型得出,均差=0.16(95%可信区间-1.99～2.31),P=0.88。即与对照组比较,实验组对血清黄体生成素水平无明显改善作用。见图5。

图5 血清黄体生成素水平Meta分析

2.3.5 治疗后原始卵泡数量 6篇文献纳入194只小鼠,其中,实验组97只,对照组97只。异质性分析结果表明存在异质性(χ2=4 086.39,I2=100%,P<0.01),采用随机效应模型得出,均差=9.82(95%可信区间-4.21～23.85),P=0.17。即与对照组比较,实验组对原始卵泡数量无明显改善作用。见图6。

图6 治疗后原始卵泡数量Meta分析

2.3.6 治疗后初级卵泡数量 5篇文献纳入126只小鼠,其中,实验组63只,对照组63只。异质性分析结果表明存在异质性(χ2=380.99,I2=99%,P<0.01),采用随机效应模型得出,均差=11.02(95%可信区间10.56～11.47),P<0.01。即与对照组比较,实验组可增加初级卵泡数量。见图7。

图7 治疗后初级卵泡数量Meta分析

2.3.7 治疗后次级卵泡数量 5篇文献纳入126只小鼠,其中,实验组63只,对照组63只。异质性分析结果表明存在异质性(χ2=194.32,I2=98%,P<0.01),采用随机效应模型得出,均差=7.49(95%可信区间1.90～13.08),P<0.01。即与对照组比较,实验组可增加次级卵泡数量。见图8。

图8 治疗后次级卵泡数量Meta分析

2.3.8 治疗后闭锁卵泡数量 5篇文献纳入144只小鼠,其中,实验组72只,对照组72只。异质性分析结果表明存在异质性(χ2=143.13,I2=97%,P<0.01),采用随机效应模型得出,均差=-7.67(95%可信区间-13.94～-1.41),P=0.02。即与对照组比较,实验组可减少闭锁卵泡数量。见图9。

图9 治疗后闭锁卵泡数量Meta分析

2.3.9 治疗后小鼠体质量 3篇文献纳入86只小鼠,其中,实验组43只,对照组43只。异质性分析结果表明存在异质性(χ2=41.77,I2=95%,P<0.01),采用随机效应模型得出,均差=3.92(95%可信区间0.51～7.34),P=0.02。即与对照组比较,实验组可增加治疗后小鼠体质量。见图10。

图10 治疗后小鼠体质量Meta分析

2.3.10 治疗后卵巢质量 2篇文献纳入70只小鼠,其中,实验组35只,对照组35只。异质性分析结果表明不存在异质性(χ2=0.53,I2=0%,P=0.47),采用固定效应模型得出,均差=1.06(95%可信区间0.88～1.23),P<0.01。即与对照组比较,实验组可增加治疗后卵巢质量。见图11。

图11 治疗后卵巢质量Meta分析

2.3.11 治疗后小鼠发情周期 2篇文献纳入48只小鼠,其中,实验组24只,对照组24只。异质性分析结果表明存在异质性(χ2=4.41,I2=55%,P=0.11),采用随机效应模型得出,均差=-1.41(95%可信区间-1.97～-0.85),P<0.01。即与对照组比较,实验组可缩短小鼠发情周期。见图12。

图12 治疗后小鼠发情周期Meta分析

2.3.12 治疗后小鼠每窝产仔数 2篇文献纳入30只小鼠,其中,实验组15只,对照组15只。异质性分析结果表明不存在异质性(χ2=0.01,I2=0%,P=0.92),采用固定效应模型得出,均差=6.18(95%可信区间5.24～7.12),P<0.01。即与对照组比较,实验组可增加小鼠每窝产仔数。见图13。

图13 治疗后小鼠每窝产仔数Meta分析

3 讨论

POI也称为卵巢早衰,已成为女性不孕的重要原因,近年来的发病率呈不断增长趋势[18]。激素替代疗法可以缓解雌激素缺乏相关症状,但无法逆转卵巢功能[19]。现有的治疗POI的方法临床效果均不理想并可能导致不良反应,因此,有必要寻求更好的治疗方法。干细胞具有自我更新和多向分化的特点,具有恢复POI患者卵巢功能的潜力,而干细胞治疗卵巢的研究主要集中于间充质干细胞[4]。有研究表明,与其他种类干细胞相比,hUC-MSCs独特的低免疫原性和强大的分泌功能使其有着更大的临床应用前景[20]。但干细胞在POI中的临床应用尚不广泛,尚无公认的最佳治疗剂量,缺少高质量的临床对照研究。本荟萃分析从动物研究方面评估了hUC-MSCs对POI的影响,以期为POI的治疗策略选择提供更多的参考。结果显示,干细胞治疗对POI小鼠模型有效,在POI小鼠模型中,干细胞可以改善激素水平、卵泡计数、发情周期及妊娠结局。其机制包括归巢效应、抑制颗粒细胞凋亡、自分泌和旁分泌作用等。归巢效应是指干细胞在靶组织的脉管系统里被捕获,随后跨越血管内皮细胞迁移至靶组织。在多种疾病的干细胞临床应用过程中均可见牢固的粘附、爬行、扩散及跨内皮细胞迁移的归巢过程,且其受趋化因子调控[21-22]。Liu等[21]发现,SDF-1/CXCR4轴可以促进干细胞迁移,提高细胞生长因子和血管内胚层生长因子的分泌。Cheng等[22]在小鼠心肌缺血模型中发现,与单独应用间充质干细胞比较,上调CXCR4可增加间充质干细胞对缺血心肌的归巢,改善心肌功能。颗粒细胞是评价卵巢功能的重要指标。Liu等[23]在人经血干细胞移植后发现,小鼠卵巢组织中mRNA表达与人卵巢组织相似,表明人经血干细胞在小鼠体内分化为卵巢颗粒样细胞。干细胞的自分泌和旁分泌介质被认为是治疗POI的关键。骨髓间充质干细胞分泌的血管内皮生长因子可促进卵巢血管生成,为损伤组织提供营养,血管内皮生长因子-1和血管内皮生长因子-2在抑制颗粒细胞凋亡和促进卵泡发育中发挥重要作用[24]。有学者发现,hUC-MSCs可以通过旁分泌途径改变卵巢微环境,提高血清雌激素水平,降低血清卵泡刺激素水平[25]。Yin等[26]发现,hUC-MSCs分泌的血红素加氧酶-1在修复卵巢中发挥关键作用,其主要机制是激活JNK/Bcl-2信号通路,上调CD8+CD28- T细胞的循环。此外,干细胞还可以上调抗炎因子的表达,下调促炎因子的表达,从而减轻卵巢内的炎症反应[27]。

本研究存在一些局限性:部分参数的样本量较低,可能影响结果的可靠性;异质性来源尚不清楚,可能与不同的POI建模方法、不同的血清收集时间有关;移植物排斥反应是一个重要的指标,但在所有纳入的研究中均未提及。

综上所述,干细胞治疗POI小鼠模型有效,其是一种潜在的恢复POI患者生育能力的治疗策略,但在临床应用前还需要进一步开展高质量的临床和基础研究来评价干细胞治疗POI的安全性、可行性及有效性。