正交试验结合响应曲面法优化辣椒红色素的提取工艺
2024-03-13杨丽霞黄海华郭维婷韩思思刘慧敏
杨丽霞，黄海华，郭维婷，韩思思，刘慧敏，薛 舒
（山西中医药大学 中药与食品工程学院，山西晋中 030619）
0 引言
辣椒红色素是从红辣椒中提取的天然着色剂，主要着色成分为辣椒红素和辣椒玉红素，属类胡萝卜素，占总量的50%～60%。辣椒红色素性状稳定，色泽鲜艳，色价高，着色力强，保色效果好，安全性高，国际上将其列入A类色素［1］。但是由于红辣椒中辣椒碱类化合物含量高，提取所得辣椒红色素呈辛辣味，使其在食品加工、医疗保健和化妆品等行业的应用受到限制。
本文选用辣度低的“北京红”辣椒为原料，以乙酸乙酯为溶剂，在浸提过程中合理应用超声技术，缩短提取时间、强化浸提效果、实现有机试剂的循环利用，建立超声辅助热浸提红辣椒中辣椒红色素的提取方法。并对粗产品进一步纯化，得到高色价的辣椒红色素，发挥其色泽艳丽鲜明的优势，进一步拓展其应用领域。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
“北京红”辣椒（产于山西省忻州市，9月采收）；乙酸乙酯、无水乙醇、丙酮、石油醚、氢氧化钠（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）。
UV-6100S型紫外可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）；IRAffinity-1S型傅里叶变换红外光谱仪（日本京都株式会社岛津制作所）；RE-52AA型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；GZX-9246MBE型电热鼓风干燥箱（上海博迅实业有限公司）；SB-5200DTDN型超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；CP214型电子天平（奥豪斯仪器（常州）有限公司）。
1.2 试验方法
1.2.1 原料处理
采摘成熟红辣椒，去除杂质和坏椒，去蒂，去籽，鼓风干燥箱中按设定程序升温干燥，打粉，过30目筛，得辣椒粉末。
1.2.2 单因素优化辣椒红色素的提取工艺
（1）不同溶剂对提取的影响
分别以乙酸乙酯、无水乙醇、石油醚为提取溶剂。精确称量辣椒粉末5.000 0 g，加对应提取溶剂。100%功率恒温超声提取30 min，60 ℃水浴热浸提1 h，抽滤，润洗，合并滤液，转移至平底烧瓶。减压蒸馏回收溶剂，原瓶挥发至恒重，得辣椒红色素粗品，计算得率。将恒重后的辣椒红色素粗品溶于丙酮，定容至50 mL容量瓶，取0.06 mL定容至10 mL容量瓶，测定吸光度值，计算色价E。考察不同溶剂对辣椒红色素提取的影响。
（2）超声条件和热浸条件对提取的影响
精密称取5.000 0 g辣椒粉，置于圆底烧瓶中，按1∶4～1∶9料液比加入提取溶剂，30～70 ℃超声提取20～40 min后，40～80 ℃恒温水浴热浸1～3 h，提取1～3次。抽滤，润洗，合并滤液，转移到50 mL容量瓶中，定容。取0.06 mL定容至10 mL容量瓶，测定吸光度值，计算E。分别考察超声时间、超声温度、料液比、热浸温度、热浸时间、提取次数对所得辣椒红色素色价的影响。
1.2.3 正交试验优化提取工艺
在单因素试验基础上，每个因素设计3个水平，建立L18（35）正交试验。综合考察超声时间（A）、超声温度（B）、料液比（C）、热浸温度（D）、热浸时间（G）对提取工艺的影响。
1.2.4 响应面试验优化提取工艺
在正交试验基础上，选取显著性影响因素超声时间、超声温度、热浸时间为自变量，色价为响应值，应用Design Expert 8.0.6软件设计响应面试验，优选辣椒红色素的提取工艺。
1.2.5 辣椒红色素的纯化
采用皂化去酯法纯化辣椒红色素。取粗品油状辣椒红色素Ⅰ（E=160～170）12.361 1 g，加入质量百分浓度15%氢氧化钠、60%乙醇的混合液12.5 mL，90 ℃恒温搅拌1 h，进行皂化。用饱和食盐水将皂化物洗至pH=7，于5 000 r/min离心作用20 min得中性皂化物。将中性皂化物用丙酮萃取3次，过滤，合并滤液，减压蒸馏得辣椒红色素Ⅱ。将辣椒红色素Ⅱ溶于35 mL的石油醚中，水浴加热沸腾后，放入4 ℃冰箱中过夜，冷却结晶，得到辣椒红色素Ⅲ。
1.2.6 色价测定
按照GB 1886.34—2015《食品安全国家标准食品添加剂 辣椒红》进行色价测定和计算。
1.2.7 红外光谱分析
取200目干燥、光谱纯溴化钾粉末约200 mg，辣椒红色素Ⅲ 1～2 mg置于玛瑙研钵中，研细混匀，压片。采集样品光谱。
1.2.8 统计学方法
应用SPSS 19.0统计软件进行分析，计量数据用平均值±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验。“P＜0.05”表示差异有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 提取溶剂的确定
由图1可知，与乙酸乙酯相比，无水乙醇提取得率显著性提高（P＜0.01）；石油醚提取得率无显著性变化。同时，与乙酸乙酯相比，其他溶剂提取所得色素的色价均显著性下降（P＜0.01）。权衡得率与色价，选用乙酸乙酯作为提取溶剂较为合理。
图1 不同提取溶剂对得率和色价的影响Fig.1 Effects of different extraction solvents on yield and color value
2.2 超声条件和热浸条件的确定
由图2单因素试验结果可得超声辅助热浸提辣椒红色素的最佳条件：超声时间35 min，超声温度60 ℃，料液比1∶6，热浸温度60 ℃，热浸时间2 h，提取1次。
图2 超声条件和热浸条件对辣椒红色素色价的影响Fig.2 Effects of ultrasonic and hot soaking conditions on color value of Capsanthin
2.3 正交试验优化
固定提取次数为1次，其他5个因素3个水平的正交试验结果及极差分析见表1。
表1 正交试验结果与极差分析Tab.1 Orthogonal test results and range analysis
各因素对色价的影响程度：超声温度＞超声时间＞热浸时间＞料液比＞热浸温度，最佳提取条件为A1B1C2D2G1，即超声时间30 min，超声温度50 ℃，料液比1∶6，热浸温度60 ℃，热浸时间1.5 h。
采用SPSS 19.0对正交试验结果进行方差分析，见表2。可得超声时间、超声温度、热浸时间对辣椒红色素色价有显著影响，与直观分析结果一致。
表2 主体间效应的检验Tab.2 Test of inter-subject effect
2.4 响应面优化试验结果
2.4.1 响应面试验设计及结果
采用Box-Behnken响应面法设计超声时间、超声温度和热浸时间，三因素三水平共17组试验，分别测定色价。采用Design Expert 8.0.6对17组试验数据和结果进行回归拟合，得到色价对3个因素的二次多项回归模型：E=173.29-4.06A-1.90B-3.02G+7.65AB-4.74AG-1.82BG+8.75A2-14.83B2-28.47G2。对所得模型进行显著性检验，结果见表3。可知回归模型的P=0.001 4＜0.01，说明模型显著；失拟项P=0.301 5＞0.05，表明失拟不显著；模型的R2=0.943 0，R2adj=0.869 7，说明该模型可以解释86.97%试验数据的变异性，模型与实际试验拟合程度良好［2-3］，用该模型分析与预测辣椒红色素的提取合适。3个因素对色价值的主次影响顺序依次为超声时间＞热浸时间＞超声温度。
表3 响应面设计各因子效应的方差分析Tab.3 Analysis of variance of response surface design factors
对三因素之间的交互作用进行响应面分析［4-6］，绘制响应面曲线图，如图3所示。交互项AG和BG对结果影响较大，交互项AB对结果影响较小。
图3 交互作用对辣椒红色素色价的影响Fig.3 Effect of interaction on color value of Capsanthin
2.4.2 最佳工艺的确定
由Design Expert 8.0.6软件分析得，提取辣椒红色素的最佳工艺条件为超声温度48.643 ℃、超声时间28.578 min、热浸时间1.488 h，该条件下提取所得产品色价理论值为174。考虑到实际生产操作的可行性，将工艺条件修正为超声温度49 ℃、超声时间29 min、热浸时间1.5 h。经3次验证试验，得提取辣椒红色素的色价为172±6，RSD=3.50%，说明该模型所得结果可靠，所建模型具有良好预测性。进一步皂化去酯后色价达到989±25。
2.5 红外光谱分析
辣椒红色素的红外吸收光谱如图4所示，在3 359 cm-1处存在吸收峰，对应O-H的伸缩振动（3 500～3 200 cm-1）；在2 927 cm-1处存在吸收峰，对应C-H的伸缩振动（3 000～2 850 cm-1）；在2 034 cm-1处存在吸收峰，对应C=O的伸缩振动（1 730～1 705 cm-1）；在1 550 cm-1处存在吸收峰，对应C=C的伸缩振动（1 650～1 500 cm-1）。说明这些都是辣椒红色素中辣椒红素和辣椒玉红素的特征官能团［7］。
图4 辣椒红色素红外吸收光谱图Fig.4 Infrared absorption spectra of Capsanthin
3 结语
通过将单因素试验、正交试验、响应面试验相结合，筛选出影响超声辅助热浸提辣椒红色素工艺的显著性因素，即超声温度、超声时间和浸提时间。优选出超声辅助热浸提最佳工艺：以乙酸乙酯为提取溶剂，超声时间29 min，超声温度49 ℃，料液比1：6，热浸温度60 ℃，热浸时间1.5 h，提取1次，该条件下提取所得辣椒红色素为深红色油状液体，产品色价约为172，符合GB 1886.34-2015对色价的要求（E11%cm460 nm≥50）。
