吡非尼酮对人肝星状细胞LX2增殖、活化以及糖酵解途径的影响*

李雪莹, 姜虹羽, 张帅, 周石, 段庆红

(1.贵州医科大学 医学影像学院, 贵州 贵阳 550004; 2.贵州医科大学附属肿瘤医院 GCP机构办公室, 贵州 贵阳 550001; 3.贵州医科大学附属肿瘤医院 影像科, 贵州 贵阳 550001)

肝纤维化是继发于多种慢性肝损伤的重要病理过程之一,是肝硬化和肝癌的前期疾病,及时干预肝纤维化是预防肝癌的重要手段[1]。肝脏慢性损伤的修复过程中,静止于Disse空间的肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)活化启动肝纤维化,肝内细胞外基质(extracellular matrix,ECM)异常增多和过度沉积,肝内正常组织被纤维瘢痕取代[2-4]。HSCs活化的过程需要大量能量的支持,研究发现活化型HSCs(activated hepatic stellate cells,aHSCs)能量代谢发生改变,细胞进行代谢重编程快速获取大量能量,其增殖能力明显增强、ECM产生增多[5-6]。静息态HSCs 活化过程中有氧糖酵解增强,诱导大量乳酸产生,导致乳酸堆积[7],并且促进葡萄糖转运体 1(glucose transporter 1,GLUT1)、丙酮酸激酶(pyruvate kinase M2 isoform,PKM2)的高表达[8-9]。靶向HSCs 细胞活化时的能量代谢或许可以成为一个新的抗肝纤维化靶点。然而目前尚无基于病理生理学的抗肝纤维化药物应用于临床,寻找新的安全有效的抗肝纤维化药物亟待解决。吡非尼酮(pirfenidone, PFD)是一种新型的小分子抗纤维化药物,临床上用于治疗特发型肺纤维化并展现出较好的疗效[10],但其具体机制尚不完全明晰。PFD服用后在人体及动物中吸收迅速并在肝、肾、肺等血流丰富器官中浓度较高[11]。基于药物代谢特点,PFD有希望作为抗肝纤维化药物。本研究以糖酵解途径为着手点,探讨PFD对转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)诱导活化的人肝星状细胞LX2的抗纤维化作用,为其治疗肝纤维化提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 细胞及试剂

人肝星状细胞株LX2(上海富衡生物科技有限公司),胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、高糖DMEM培养基(北京赛澳美细胞技术公司),青-链霉素(美国Hyclone公司),TGF-β1(美国Peprotech公司),吡非尼酮(北京康蒂尼药业股份有限公司),二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)、4%多聚甲醛溶液、0.1%结晶紫染液、全蛋白提取试剂盒(北京索莱宝科技有限公司),CCK-8试剂(上海陶术生物公司),葡萄糖检测试剂盒(上海荣盛生物药业公司),乳酸检测试剂盒(南京建成生物工程研究所),stain-free胶(美国Bio-Rad公司),BCA蛋白浓度定量试剂盒(上海碧云天生物技术公司),PVDF膜(美国Millipore公司),高敏ECL曝光液(北京四正柏生物科技有限公司),鼠抗人α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)单克隆抗体、兔抗人乳酸脱氢酶A(lactate dehydrogenase A, LDHA)单克隆抗体(美国Novus Biologicals公司),兔抗人胶原Ⅰ(collagenⅠ, COL1A1)单克隆抗体、兔抗人GLUT1单克隆抗体(美国Abcam公司),兔抗人己糖激酶 2(hexokinase 2, HK2)单克隆抗体、兔抗人PKM2单克隆抗体(美国Cell signaling公司),鼠抗人血小板型磷酸果糖激酶(recombinant phosphofructokinase, platelet, PFKP)单克隆抗体(美国SANTA CRUZ公司),兔抗人单羧酸转运蛋白-1(monocarboxylate transporter 1, MCT1)多克隆抗体(上海爱必信生物科技有限公司),鼠抗人β-肌动蛋白(β-actin)单克隆抗体、兔抗人微管蛋白(tublin)单克隆抗体(美国Affinity公司),PCR所用引物序列由上海生工生物公司合成,Trizol试剂(美国Thermo Fisher Scientific公司),PCR试剂盒(美国MCE公司)。

1.2 研究方法

1.2.1细胞培养基分组 于37 ℃、5% CO2培养箱中,用含有10% FBS、100 000 U/L青-链霉素的高糖DMEM培养基培养LX2细胞,每2 d更换培养液,传2～3代后用于后续实验。设置6个组,分别为正常组(0.1 % DMSO)、对照组(10 μg/L TGF-β1+ 0.1 % DMSO)、实验组(10 μg/L TGF-β1 + 2、4、6及8 mmol/L PFD)。每次铺板LX2细胞贴壁后,用含1% FBS的DMEM培养液饥饿细胞24 h,加入含或不含10 μg/L TGF-β1的10% FBS的DMEM培养基刺激12 h,用相应药物处理。

1.2.2CCK-8实验检测细胞增殖能力 96 孔板内接种对数生长期LX2细胞,每孔约 5×103个细胞,按“1.2.1”中分组处理后分别培养12、24、36、48、60及72 h,每个组设置至少3个复孔。检测时弃去培养基,每个孔加含10 %CCK-8溶液的无血清DMEM培养基,继续在培养箱培养2 h,波长 450 nm 处检测各孔吸光度,计算细胞增殖率。细胞增殖率(%)=[(实验孔吸光度-空白孔吸光度)/(对照孔吸光度-空白孔吸光度)]× 100%。

1.2.3平板克隆形成实验检测细胞增殖能力 6孔板中以100～200个 /孔的密度接种对数生长期LX2细胞,按“1.2.1”分组处理24 h后培养10～14 d,在显微镜下观察可见克隆细胞团时,弃去培养基,PBS洗2次,4 %多聚甲醛溶液固定各组细胞20 min后,0.1 %结晶紫染色10 min,PBS反复清洗至无染液残留,完全干燥后拍照计数。

1.2.4上清中葡萄糖及乳酸的测定 6孔板中以3×105/孔的密度接种对数生长期LX2细胞,按照“1.2.1”中分组处理后,分别于培养12、24、36、48、60及72 h时收集上清液离心,按葡萄糖测量剂盒说明加入检测样本、检测试剂,充分混匀,37 ℃水浴中反应10 min,测定505 nm波长处吸光度值。培养液中葡萄糖浓度(mmol/L)=[(测定孔吸光度-空白孔吸光度)/(标准孔吸光度-空白孔吸光度)]×5.5 mmol/L。按照乳酸测量剂盒说明加入样本、酶工作液、显色剂,混匀,37 ℃ 水浴中准确孵育 10 min,加入终止液,使用酶标仪测定530 nm波长处吸光度值,计算培养液中乳酸浓度。培养液中乳酸浓度=培养液中葡萄糖浓度(mmol/L)=[(测定孔吸光度-空白孔吸光度)/(标准孔吸光度-空白孔吸光度)]×3 mmol/L×稀释倍数。

1.2.5蛋白免疫印迹法(Western blot)检测α-SMA、COL1A1、Glut1、HK2、PFKP、PKM2、LDHA、MCT1的蛋白表达 收集各组细胞,加入裂解液裂解细胞,静置后离心取上清,用 BCA 试剂盒检测蛋白浓度。配制10 % SDS-PAGE 凝胶进行蛋白电泳,将蛋白质转移到 PVDF 膜上,用快速封闭液室温封闭15 min后,相应一抗 4 ℃ 摇床孵育过夜,次日用辣根过氧化物酶标记的IgG 二抗(稀释比例1∶10 000)室温孵育1 h,暗盒中与ECL孵育1 min后于Bio-Rad凝胶成像系统内曝光条带。用Image J软件分析目的条带灰度。

1.2.6实时定量荧光PCR法(RT-qPCR)检测α-SMA、COL1A1、Glut1、HK2、PKM2、LDHA的mRNA表达 Trizol法提取各组细胞RNA,测量总RNA 浓度,逆转录后以20 μL体系在PCR仪中扩增,引物序列见表1,扩增条件：95 ℃预变性30 s,95 ℃变性10 s,60 ℃退火延伸30 s,循环40次。

表1 引物序列表Tab.1 List of primer sequences

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 PFD对TGF-β1刺激的LX2细胞增殖能力的影响

CCK-8实验表明(图1A),与正常组相比,36 h时对照组的LX2细胞增殖率增高,差异有统计学意义(P<0.05);与对照组比较,实验组PFD处理36 h开始呈剂量依赖性降低TGF-β1刺激的LX2细胞增殖率,差异有统计学意义(P<0.05)。平板克隆形成实验(图1B、1C)中,对照组LX2细胞克隆数比正常组增多,差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比,实验组LX2细胞克隆数呈时间-剂量依赖性降低,差异有统计学意义(P<0.05)。

注：A为不同时间点CCK-8实验结果,B、C为平板克隆形成实验结果;(1)与同时点对照组比较,P<0.05。

2.2 PFD对TGF-β1刺激的LX2细胞活化的影响

与正常组比较,对照组中LX2细胞活化标志之一的α-SMA及细胞外基质重要组成的COL1A1蛋白表达水平升高,差异有统计学意义 (P<0.05);与对照组比较,实验组中PFD以剂量依赖方式降低活化的LX2细胞α-SMA、COL1A1蛋白表达(P<0.05, 图2A、2B)。RT-qPCR结果也显示(图2C),与正常组比较,对照组LX2细胞(-SMA及COL1A1 mRNA相对表达量增加,差异有统计学意义(P<0.05);与对照组比较,实验组LX2细胞在不同浓度PFD处理后,α-SMA及COL1A1 mRNA相对表达量呈剂量依赖性降低 (P<0.05)。

注：A、B为各组α-SMA、COL1A1蛋白电泳条带和相对定量结果,C为各组α-SMA、COL1A1 mRNA相对表达水平;(1)与对照组比较,P<0.05。

2.3 PFD对TGF-β1刺激的LX2细胞外葡萄糖及乳酸水平的影响

葡萄糖及乳酸结果显示(图3),与正常组相比,对照组LX2细胞从36 h开始出现出现上清中葡萄糖水平降低,差异有统计学意义(P<0.05);同时上清中乳酸水平升高,且从48 h开始,与正常组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。实验组LX2细胞在干预48 h时,其细胞外葡萄糖水平较同时点对照组升高,差异有统计学意义(P<0.05);除2 mmol/L组外,各组乳酸水平均较对照组降低,差异有统计学意义(P<0.05),以上改变表现出剂量依赖性。

2.4 PFD对TGF-β1刺激的LX2细胞糖酵解关键酶及相关蛋白的影响

Western blot结果(图4A、4B)显示,与正常组比较,对照组LX2细胞的Glut1、HK2、PFKP、PKM2、LDHA、MCT1蛋白表达水平升高(P<0.05),实验组LX2细胞的Glut1、HK2、PFKP、PKM2、LDHA、MCT1蛋白表达水平较对照组呈剂量依赖性降低(P<0.05)。RT-qPCR结果(图4C)显示,对照组Glut1、HK2、PKM2、LDHA mRNA的相对表达量相比正常组增加(P<0.05),且这些相关基因的mRNA相对表达量也在实验组中降低(P<0.05)。

注：A、B为各组糖酵解途径关键酶及相关蛋白电泳条带和蛋白相对定量结果,C为糖酵解途径关键酶及相关蛋白的mRNA表达水平;(1)与对照组比较,P<0.05。

3 讨论

作为肝硬化及肝癌的前期疾病,肝纤维化的病理过程在研究中被证明是可逆的[12]。HSCs是肝纤维化发生的重要响应细胞[4]。正常肝脏中的HSCs处于静止状态,胞内富含维生素A脂滴并且仅分泌少量ECM[13]。肝脏受到损伤后,HSCs下调维生素A,胶质纤维酸性蛋白和过氧化物酶体增殖物激活受体γ的表达,上调α-SMA的表达,成为活化的HSCs迁移到病理损伤处,大量分泌并积累以胶原为主的ECM,产生纤维瘢痕,取代受损的正常肝组织[14-16]。TGF-β1是目前已知最强的促纤维化因子,以Smad2/Smad3依赖的方式激活HSCs[17],活化后的HSCs增殖能力增强,ECM分泌增多。本实验中CCK-8和平板克隆实验显示,通过TGF-β1刺激后的LX2细胞的增殖能力增加,并且PFD以时间-剂量依赖的方式抑制活化后的LX2细胞的增殖能力,提示PFD可以抑制LX2细胞的增殖和活性。TGF-β1刺激HSCs活化后,其活化标志α-SMA及ECM主要成分胶原Ⅰ的蛋白及mRNA表达上调,而在使用PFD后α-SMA、COL1A1蛋白及mRNA 表达降低,表明PFD能抑制HSCs的活化及ECM过度沉积, 从而达到干预肝纤维化的目的。

HSCs的活化是公认的肝纤维化产生的基础,其活化状态的发生和维持需要大量能量来维持。之前研究已证明活化的HSCs利用有氧糖酵解快速产能保持其高度增殖的需求,类似于肿瘤中的“Warburg”效应[18],同时持续的能量供应也为ECM的不断产生提供了便利[7]。葡萄糖是糖酵解的反应底物,通过细胞膜上GLUT进入细胞内,在HK、PFK、PK、LDH等糖酵解酶的催化下生成乳酸,同时产生2分子ATP,乳酸在MCT催化下释放[19-20]。本研究中对培养上清中代谢物的检测显示通过TGF-β1刺激后的LX2细胞葡萄糖消耗及胞外乳酸积累增多,并上调糖酵解关键酶及相关转运蛋白的蛋白及mRNA表达,这些改变与有关报道HSCs有氧糖酵解增强时,葡萄糖、乳酸和糖酵解关键酶及相关蛋白的变化一致[7-8,21],这些改变可能与活化的HSCs进行代谢重编程有关。除在有氧情况下HSCs进行代谢重编程外,HSCs很可能也在同时存在缺氧的情况下进行无氧糖酵解,HSCs活化后大量分泌ECM,Disse空间或细胞外间隙中的Ⅳ型胶原被Ⅰ型胶原纤维和Ⅲ型胶原取代[22],氧气交换空间被压缩,局部出现缺氧改变,细胞缺氧诱导缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor 1,HIF-1α)转录增强和稳定[23],HIF-1α可过表达GLUT、HK2、PKM2、LDHA等多种糖酵解相关蛋白和酶[24]。在既往研究中,姜黄素通过下调原代小鼠HSCs的HK2、PFK、GLUT4改善了小鼠肝纤维化[25],Mejias等[26]通过下调HSCs中PFKFP3降低糖酵解水平以抑制小鼠HSCs的活化,改善小鼠肝纤维化。本研究中PFD干预降低了TGF-β1刺激的LX2细胞葡萄糖消耗及胞外乳酸积累,同时下调LX2细胞糖酵解关键酶及相关转运蛋白的表达,也表明PFD能下调活化的HSCs糖酵解水平,干扰HSCs的能量代谢,但其与HIF-1β关系如何及具体分子机制需在今后研究中验证。

综上所述, PFD可以抑制人HSCs的增殖、活化及ECM的过度沉积,起到抗肝纤维化作用。同时提示PFD抗肝纤维化作用可能与糖酵解水平下调、细胞能量代谢受扰相关,但其影响HSCs糖酵解的具体分子机制尚需进一步的研究。