氧化低密度脂蛋白对人脐静脉内皮细胞增殖及 circRNA-CER表达的影响*

陈万, 王小静, 刘晗, 赵郑波

(1.重庆市九龙坡区人民医院 心内科, 重庆 400050; 2.重庆市九龙坡区人民医院 神经内科, 重庆 400050; 3.重庆市渝北区中医院 心内科, 重庆 401121)

动脉粥样硬化是导致众多心血管疾病的基础病理改变,其发病率在世界范围内呈逐年增加的趋势,给全球经济社会的发展带来了严重的负担[1]。目前临床上主要通过降脂疗法延缓疾病的进展,却无法完全抑制或逆转疾病的进程。因此探明动脉粥样硬化的发病机制有助于为该病的防治提供新的诊治靶点。动脉粥样硬化的发病机制极为复杂,学术界中存在脂质浸润、血管内皮损伤、血管平滑肌细胞过度增殖等多种假说。其中,血管内皮细胞损伤是诱导动脉粥样硬化的始发因素,多项研究证实改善血管内皮功能具有抑制动脉粥样硬化的作用,提示保护血管内皮细胞是一项潜在有效的抗动脉粥样硬化治疗策略[2]。CircRNA是一类含有共价闭环结构的RNA,具有表达丰度高、稳定性强(抵抗核酸外切酶)、保守性强、时空及组装表达特异性等特点,因此可成为潜在的疾病生物标志物。CircRNA常以“海绵样”作用吸附miRNA或与蛋白结合发挥生物学作用,近年来发现circRNA也可编码蛋白或短肽,从而在生长发育、恶性肿瘤及心血管疾病等发病中发挥关键作用[3-5]。有研究报道,hsa_circ_0010729通过miR-186/HIF-1α调控轴影响血管内皮细胞的增殖和凋亡[6]。提示circRNA与血管内皮细胞的功能密切相关,其有望成为保护血管内皮细胞免受氧化低密度脂蛋白(oxidized lipoprotein, ox-LDL)的损害、抵抗动脉粥样硬化发病的潜在新型靶点。本研究经前期筛选发现circRNA-CER在ox-LDL刺激下的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)表达明显下调。然而,circRNA-CER在动脉粥样硬化中对血管内皮细胞功能的调节作用和具体生物学机制还未完全阐明,其是否能成为诊治动脉粥样硬化的新靶点还有待进一步评估。本研究旨在探讨circRNA-CER在ox-LDL的诱导下对血管内皮细胞增殖的影响以及其作为miRNA“分子海绵“机制的探讨,以期为动脉粥样硬化的靶向治疗提供新的线索。

1 材料与方法

1.1 实验材料

HUVEC购于武汉原生原代公司,胎牛血清购于Gibico公司,1640培养基购于Hyclon公司,ox-LDL购于广州弈源生物。质粒由上海汉恒公司合成。miRNA-136 mimic及检测试剂盒购于广州锐博生物科技有限公司,LipofectamineTM2000购于Invitrogen公司,CCK8购自MCE公司,TRIzol购于ThermoFisher公司,逆转录试剂、SYBR Green购于TAKARA公司。引物由生工设计并合成;RIPA裂解液、PMSF、BCA试剂盒、6X蛋白上样缓冲液、荧光素酶报告基因检测试剂盒购于碧云天公司;GAPDH、VEGF抗体购于武汉三鹰公司;荧光二抗购于LI-COR公司。

1.2 研究方法

1.2.1HUVEC细胞培养及处理 培养使用含有20%胎牛血清的1640培养基(Hyclon),放置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。待细胞汇合度为60%～70%时进行ox-LDL刺激、质粒或miRNA mimic转染。ox-LDL按浓度梯度(0、40、60、80、100及200 mg/L)处理24 h或以100 mg/L按时间梯度(0、6、12、24及48 h)处理。后续实验按照ox-LDL 100 mg/L处理细胞24 h。质粒转染使用转染试剂LipofectamineTM2000,按照说明书操作,6 h后换液。pcDNA3.1质粒作为对照组。

1.2.2qRT-PCR实验 使用TRIzol法提取细胞总RNA,用一步法逆转录试剂按1 μg RNA反应体系进行逆转录,反应程序为：37 ℃ 15 min,85 ℃ 15 s。采用SYBR Green荧光染料进行实时定量PCR反应,程序为：95 ℃ 3 min,95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共进行39个循环。每个样品设置3个复孔。以GAPDH作为内参照。2-ΔΔCt法计算相对表达量。miRNA-136的检测使用专用试剂盒。引物序列：CircRNA-CER 上游引物为5′ -CTGGTGCAGTGGAAGCAGAG-3′ ,下游引物为5′ - CGACCCTCCATTGCTCTTCT -3′;GAPDH 上游引物为5′ -GGGAAACTGTGGCGTGAT-3′,下游引物为5′-GAGTGGGTGTCGCTGTTGA -3′。

1.2.3CCK8实验 在96孔板中接种并处理细胞,检测时加入CCK8溶液(10 μL/孔)和培养基(90 μL/孔),分别转染pcDNA3.1对照组和circRNA-CER过表达质粒组。细胞培养箱中孵育2 h后,使用酶标仪测量吸光度OD450值。

1.2.4Western blot检测 使用RIPA裂解液提取细胞总蛋白,其中添加PMSF以防止蛋白降解,BCA法进行蛋白浓度的测定,加入6×蛋白上样缓冲液,100 ℃加热10 min。使用10% SDS-PAGE凝胶进行80 V恒压电泳,将分离后的蛋白转至NC膜,室温下使用5%脱脂奶粉封闭1 h,4℃孵育一抗GAPDH (1∶10 000)、VEGF (1∶500)过夜。复温后用TBST缓冲液洗膜3次,避光并于室温中孵育荧光二抗(1∶10 000)1 h,TBST缓冲液洗膜3次。LI-COR荧光成像仪中进行成像,通过Quantity One软件分析灰度值。

1.2.5荧光素酶报告基因 由上海汉恒生物科技有限公司分别构建circRNA-CER、VEGF 3′UTR荧光素酶报告基因质粒。在96孔板中接种细胞并进行miR-136 mimic处理,同时转染circRNA-CER或VEGF 3′UTR报告质粒,以mimic NC处理作为对照。使用荧光素酶报告基因检测试剂盒(碧云天)按操作说明进行检测。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 CircRNA-CER在ox-LDL刺激下的血管内皮细胞中低表达

结果如图1所示,ox-LDL对HUVEC中circRNA-CER的表达呈现浓度与时间的依赖性。随ox-LDL浓度的增加,circRNA-CER表达呈下调趋势,并在100 mg/L ox-LDL处理时差异有统计学意义(下降72.9%,P<0.05)。在以ox-LDL 100 mg/L刺激后发现,circRNA-CER表达随处理时间延长呈下调趋势,在24 h处发生下调(下降73.5%,P<0.05)。继续加大ox-LDL浓度或延长处理时间对circRNA-CER的表达抑制影响有限。故circRNA-CER在100 mg/L ox-LDL处理HUVEC 24 h后表达下调最显著,选择以该浓度及时间作为后续实验条件。

注：A为circRNA-CER在ox-LDL浓度梯度刺激24 h后的表达,B为circRNA-CER在ox-LDL 100 mg/L浓度下随时间梯度的表达;(1)与0 mg/L ox-LDL组比较,P<0.05;(2)与0 h比较,P<0.05。

2.2 验证circRNA-CER表达质粒效率

用circRNA-CER过表达质粒转染HUVEC,以空载质粒作为对照。24 h后运用qRT-PCR检测circRNA-CER的表达量。图2结果显示：过表达组中circRNA-CER的表达水平显著高于对照组(P<0.01)。

2.3 过表达circRNA-CER阻止ox-LDL发挥抑制HUVEC增殖的作用

通过CCK8实验检测细胞增殖能力,结果如图3所示,与对照组相比,ox-LDL处理组细胞在450 nm处OD值降低(P<0.05),而在ox-LDL刺激的同时过表达circRNA-CER可逆转ox-LDL单独处理引起的细胞增殖抑制效应。

2.4 CircRNA-CER结合miR-136影响VEGF表达

通过qRT-PCR检测miR-136的细胞表达水平。图4A结果显示,过表达circRNA-CER后miR-136的表达量较对照组下调(下降53.3%,P<0.05);Western blot实验证实,在circRNA-CER过表达的同时增加miR-136表达量可抑制单独过表达circRNA-CER对VEGF蛋白表达的促进作用,提示circRNA-CER对 VEGF的表达调控受miR-136的影响(图4B)。荧光素酶报告基因实验结果显示,circRNA-CER与miR-136以及miR-136与VEGF 3′UTR之间存在直接结合位点(图4C)。

3 讨论

作为miRNA发挥“分子海绵”样作用是circRNA最早发现、研究最多的主要生物学功能之一[7]。circRNA具有与竞争性内源RNA(ceRNA)相似的作用机制,即通过“吸附”miRNA进而解除miRNA对下游靶基因的表达抑制,最终恢复靶基因的表达[8]。已有大量文献报道,“circRNA-miRNA-靶基因”调控轴参与多种疾病的发病[9-12]。除此之外,circRNA与RNA结合蛋白的结合和相互作用是其另一大作用机制[13]。而新近发现的circRNA编码蛋白进一步丰富了基因调控的多样性[14-16]。而在血管形成和发育中,VEGF信号传导发挥了关键的调控作用。VEGF诱导相关基因表达,调控血管的通透性并促进血管内皮细胞的迁移、增殖和存活[17]。有研究表明,在ox-LDL的损伤刺激下激活VEGF可发挥对血管内皮细胞的保护作用,从而起到抗动脉粥样硬化的效果[18]。因此,探索调控VEGF表达的分子机制具体重要的意义。既往研究表明,部分circRNA例如circPDS5B、circRNA_06354可通过miRNA调控血管内皮细胞中VEGF的表达[19-20]。然而,其在ox-LDL导致的血管内皮细胞损伤的相关研究中却机制不明。

本研究检测到HUVEC在ox-LDL的浓度和时间梯度刺激下,细胞中circRNA-CER的表达呈下调趋势。在构建并转染circRNA-CER过表达质粒后,通过CCK8实验发现,ox-LDL处理抑制HUVEC细胞增殖,而过表达circRNA-CER可消除该损伤效应,从而起到在动脉粥样硬化中保护血管内皮细胞功能的作用。机制上,本研究还验证circRNA-CER对VEGF的表达具有促进作用。随后在筛选和验证后发现circRNA-CER可抑制miR-136的表达,而在同时干预两者后可阻断circRNA-CER对VEGF的表达促进作用,提示circRNA-CER通过miR-136影响VEGF表达。通过荧光素酶报告基因,也进一步证明了circRNA-CER与miR-136以及miR-136与VEGF 3′UTR的直接结合,提示circRNA-CER可作为miR-136的“分子海绵“解除其对靶基因VEGF的表达抑制。

综上所述,本研究发现 circRNA-CER在ox-LDL刺激下的血管内皮细胞中显著下调表达,该分子能够有效地抵抗ox-LDL对血管内皮细胞增殖的抑制作用,具有调控动脉粥样硬化发病的潜能。circRNA-CER有望成为动脉粥样硬化的新型诊疗靶点。除外,本研究后续将继续完善分子研究并引入动物疾病模型,以期深入、全面的探讨circRNA-CER在动脉粥样硬化中的生物学作用和机制。