发育性内皮基因座-1在人冠状动脉粥样硬化斑块中的表达及其与冠心病的关系*

路艳林, 周明, 李曼, 彭进, 戴佳琳, 丁九阳, 万昌武, 汪家文, 王杰***, 夏冰***

(1.贵州医科大学 法医学院, 贵州 贵阳 550004; 2.遵义医科大学医学与科技学院 基础医学院, 贵州 遵义 564600; 3.遵义医科大学 法医学院, 贵州 遵义 564600)

冠心病(coronary heart disease,CHD)是心血管系统疾病中发生猝死最常见的疾病,其发病机制仍不完全明确[1]。动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是CHD发生的病理生理基础,研究表明炎症反应是引起AS发生发展的关键因素之一,与CHD猝死直接相关[2]。目前在法医病理鉴定中,CHD引起的猝死主要是根据冠状动脉的病理形态学改变来诊断,但实践中往往缺少典型的病理形态改变,给法医鉴定带来了一定的难度。研究表明心脏标记物对CHD辅助诊断具有一定的指导意义[3]。课题组前期蛋白组学实验发现在患有CHD死者的冠状动脉中发育性内皮基因座-1(developmental endothelial locus-1,DEL-1)表达上调,提示DEL-1可能是参与CHD的相关炎性生物标记物。DEL-1是一种分子量为52 kDa的炎症因子,主要参与炎症反应的调节[4-6]。研究显示,CHD患者血清DEL-1的水平明显高于健康者[7];Kakino等[8]研究显示,DEL-1在急性炎症中主要发挥抗炎作用,而在慢性炎症中则是促进作用;提示DEL-1可能和CHD的发生发展有关。DEL-1可通过调节磷酸化糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)/CAAT增强结合蛋白β(enhanced binding proteinβ,C-EBPβ)通路参与炎症反应[6],因此本研究以人体冠状动脉组织为研究对象,直接检测DEL-1及下游GSK-3β/C/EBPβ通路蛋白在冠状动脉病灶内的表达,探讨DEL-1是否通过GSK-3β/C-EBPβ通路调节炎症反应参与CHD的发生发展,以期补充DEL-1基因在动物实验和血清实验之外人冠状动脉中的研究空白,为临床及法医学中CHD诊断、CHD猝死案件的病理学诊断提供实验依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象

本研究获贵州医科大学伦理审查委员会认可(审批号2020163),选取贵州医科大学法医司法鉴定中心冠状动脉标本共58例,分为CHD组(25例)与对照组(CON组,33例)。CHD组纳入标准：(1)尸体常温保存不超过24 h或冷冻保存不超过3 d,室温解冻24 h内尸检;(2)冠状动脉管壁内膜粥样斑块形成,伴有或不伴有继发病变形成;(3)组织病理学明确诊断为CHD(包括因CHD猝死的案例)。排除标准：(1)组织自溶或结构不清者;(2)患有心肌病、风湿性心脏病及心肌炎等心脏病者;(3)多发全身炎症性感染或中毒死亡者。按照纳入和排除标准CHD组统一选取冠状动脉左前降支狭窄程度最严重处,CON组取肉眼及组织学检查未见明显病变者左前降支。CHD组织一部分采用4%多聚甲醛固定做石蜡切片;其余部分采用液氮速冻后,-80 ℃冰箱保存供蛋白提取[9-10]。

1.2 主要试剂和仪器

鼠抗白细胞介素-17(IL-17) 单克隆抗体(Proteintech公司,US)、兔抗DEL-1多克隆抗体(Proteintech公司,US)、兔抗GSK-3β多克隆抗体(Affinity公司,US)、兔抗P-GSK3β多克隆抗体(Abcam公司,UK)、兔抗C/EBPβ多克隆抗体(Affinity公司,US)、鼠抗人β-肌动蛋白(β-actin)单克隆抗体(Abbkine公司,US)、DAB 显色试剂盒(中杉金桥公司,中国)、兔/鼠超敏二步法免疫组织化学检测试剂(中杉金桥公司,PV-9000,中国)、EasyScan数字切片扫描与应用系统(麦克奥迪实业集团有限公司,中国)、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(碧云天生物技术公司,中国)、Bio-Rad凝胶成像系统(伯乐公司,US)等。

1.3 研究方法

1.3.1冠状动脉组织学形态观察与测量 10%中性甲醛液固定1周的冠状动脉组织进行石蜡包埋、切片(3 μm)、制片、苏木素-伊红(HE)染色、中性树脂封片后,用 EasyScan 数字切片扫描,Image-Pro Plus 6.0 测量冠状动脉内膜厚度和纤维帽厚度,计算管腔狭窄程度,测量3次取均值为测量结果。

1.3.2免疫组织化学检测冠状动脉病灶内DEL-1、IL-17、 GSK-3β及C/EBPβ的表达与分布 经10%甲醛固定后的冠脉组织,行常规石蜡包埋、3 μm切片、脱蜡、水合。滴入3% H2O2于37 ℃孵育15 min以封闭内源性过氧化物酶,高压热修复抗原4 min,加一抗(IL-17,1∶100;DEL-1,1∶100; GSK-3β,1∶200;C/EBPβ,1∶200)PBS缓冲液作为阴性对照,于4 ℃冰箱孵育过夜。第2天根据一抗属性分别加入HRP标记二抗(羊抗兔IgG,1∶10 000,DEL-1、GSK-3β、C/EBPβ)或HRP标记二抗(鼠抗兔 IgG,1∶10 000,IL-17)37 ℃恒温孵育30 min后DAB显色、苏木素复染、二甲苯透明,中性树胶封片。在光学显微镜下观察DEL-1、IL-17、GSK-3β及C/EBPβ的阳性表达。阳性染色定位条件：排除边缘效应及非特异性染色,光镜下组织阳性表达着黄色、棕黄色或棕褐色,观察阳性染色在细胞内的定位和分布特点。400倍镜下采集图片,Image-Pro Plus6.0 测量阳性表达的总面积(Area)和总吸光度(IOD),计算平均吸光度(AOD)[10]。

1.3.3Western blot法检测DEL-1及其相关蛋白GSK-3β、p-GSK-3β、C/EBPβ、IL-17表达水平 -80 ℃冰箱取出冠状动脉样本,加液氮研磨致粉末,再按1 mg/20 μL比例加入蛋白裂解液,充分匀浆后冰上静置裂解30 min,提取上清液,测量蛋白总浓度,SDS-PAGE胶电泳后将目的蛋白转至PVDF膜上,加入5%脱脂牛奶封闭,分别加入适当浓度一抗(DEL-1,1∶1 000;GSK-3β及p-GSK-3β,1∶800;C/EBPβ,1∶1 000;IL-17,1∶1 000;β-actin,1∶2 000),于4 ℃摇床上孵育过夜,洗膜后加辣根过氧化物酶(horseradish per-oxidase,HRP)标记的二抗(羊抗兔IgG,1∶10 000;羊抗小鼠IgG 1∶5 000),室温孵育2 h,使用增强化学发光(ECL)液显色。以β-actin为内参照,用ImageJ软件测量条带灰度值,以测得3次均值作为最终测定结果。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 一般情况

本研究收集尸检案例冠状动脉标本58例,其中男 40例、女 18例,平均(49.67±16.23)岁;其中CON组33例,男23例、女10例,平均(47.00±17.20)岁;CHD组25例,其中男17例、女8例,平均(55.18±13.04)岁。CON组和CHD组间年龄比较,差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 冠状动脉形态学改变

HE结果显示,CON组冠状动脉内膜壁薄而平滑,内、中、外膜厚度无增厚,且均匀一致,管腔未见明显狭窄;与CON组比较,CHD组血管内膜不规则增厚、内膜下见纤维帽明显(P<0.05);CHD组中膜因斑块压迫、平滑肌萎缩受压变薄,管腔呈不同程度向心性狭窄(P<0.05),部分粥样硬化斑块内可见典型粥样坏死灶。结果见图1、表1。

图1 冠状动脉组织的组织形态学变化(HE,×200)Fig.1 Histomorphological changes of the coronary artery tissues (HE,×200)

图2 两组冠状动脉中DEL-1 、IL-17、C/EBPβ及GSK-3β的表达(免疫组织化学,×400)Fig.2 Expression of DEL-1, IL-17, C/EBPβ, and GSK-3β in coronary atherosclerotic lesions(immunohistochemical staining, ×400)

表1 冠状动脉形态学相关指标比较Tab.1 Comparison of morphological indexes of coronary artery

2.3 DEL-1、IL-17、C/EBPβ及GSK-3β 细胞定位和吸光度的变化

免疫组织化学染色结果如2图所示,CON组中,DEL-1、IL-17、C/EBPβ及GSK-3β在冠状动脉内膜处呈低表达或不表达状态。在CHD组DEL-1、IL-17、C/EBPβ及GSK-3β蛋白呈强阳性、高表达状态;IL-17、C/EBPβ及GSK-3β多表达于泡沫细胞胞质,染色呈棕黄色;DEL-1聚集性表达于泡沫细胞的胞质及胞核中,呈棕黄色、团块状或弥散颗粒样。用Image-ProPlus6.0 图像处理软件测量所染组织切片DEL-1 、IL-17、C/EBPβ及GSK-3β阳性表达的总面积Area和IOD发现,与CON组比较,CHD组上述蛋白的AOD均增高(P<0.05)。见表2。

表2 两组冠状动脉中 DEL-1 、 IL-17、C/EBPβ及 GSK-3β蛋白表达的Tab.2 AOD of DEL-1, IL-17, C/EBPβ, and GSK-3β protein expression in human coronary

2.4 冠状动脉内DEL-1及相关通路关键蛋白表达水平

Western blot检测结果如图3所示,与CON组相比,冠心病组DEL-1及其相关因子GSK-3β、p-GSK-3β,C/EBPβ,IL-17表达水平增高(P<0.05),且GSK-3β的表达水平随p-GSK-3β的升高而升高(P<0.05)。

注：(1)与CON组比较,P<0. 05。

2.5 DEL-1的表达水平与冠状动脉形态结构的关系

将DEL-1表达水平与病灶斑块结构参数做相关性分析发现,DEL-1表达水平与血管内膜厚度、管腔狭窄程度呈正相关(r=0.693、0.733,P<0.05),与纤维帽厚度呈负相关(r=-0.432,P<0.05)。见图4。

图4 DEL-1的表达水平与冠状动脉形态结构的关系Fig.4 Relationship between DEL-1 expression and coronary artery morphological structure

3 讨论

AS的发病机制学说包括慢性炎症、脂质浸润、动脉平滑肌细胞克隆、血栓形成、损伤反应等[11],其中被广泛接受的是血管壁的慢性炎症学说[12]。研究证实,在参与AS的多种因素中,斑块内炎性反应的增强与其斑块不稳定性直接相关,最终造成CHD猝死[13-15]。

DEL-1是一种由巨噬细胞及内皮细胞分泌的炎症因子,其主要作用是参与炎症调节、内质网应激等[16],其在炎症方面具有双重作用,一方面DEL-1通过抑制趋化因子配体2(CXCL2)和趋化因子3(CCL3)等趋化因子的作用而抑制炎症[17];另一方面DEL-1可通过刺激多种炎症因子释放,如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-17等,从而诱导组织炎症反应的发生[18-19]。在炎症和自身免疫性疾病中,IL-17与DEL-1相互作用使平衡偏向IL-17,此时慢性炎症被增强[20];此外,DEL-1表达水平高低与缺血性疾病的严重程度有关[21-23]。临床研究证实在CHD患者血清中,DEL-1的循环水平高于健康人群,且DEL-1的表达水平与CHD的严重程度有关[8]。本研究通过检测人冠状动脉粥样硬化斑块内DEL-1的表达,发现在CHD组中DEL-1表达上调。

研究表明,CHD晚期纤维帽变薄与动脉粥样硬化不稳定性直接相关,最终导致CHD不良事件的发生[9,13],为了探讨DEL-1与AS稳定性的关系,将DEL-1表达水平与斑块结构稳定性参数进行相关性分析,结果显示DEL-1表达水平与血管内膜厚度、管腔狭窄程度呈正相关,与纤维帽厚度呈负相关。提示DEL-1参与AS的病变演进,DEL-1的表达升高与AS斑块不稳定性有关,但其机制仍需深入探讨。研究表明,可通过GSK-3β/C-EBPβ信号通路调节DEL-1来调节炎症反应[6]。C/EBP的功能主要是调节细胞增殖分化、炎症及免疫基因的表达,而在AS中其通过促进泡沫细胞形成参与AS,表达水平随着AS病变的加重而升高[24]。GSK-3β是一种独特的多任务激酶,主要参与炎症反应和细胞凋亡的调节,相关炎症疾病研究显示,疾病组中GSK-3β的表达水平高于健康组,且GSK-3β可通过促进泡沫细胞的形成,加速了AS病变的进程[25]。IL-17是一种由辅助性T细胞(Th17)、执行固有免疫功能T细胞(γδT)、自然杀伤细胞受体(NKT)等细胞分泌的促炎因子,与多种细胞因子协同放大炎症反应,在AS疾病中起着关键性作用[26];在CHD死亡者的AS斑块中,IL-17的表达水平与斑块内继发性病变呈正相关[27]。本研究检测了人冠状动脉粥样硬化斑块内DEL-1及GSK-3β/C-EBPβ通路关键蛋白C/EBPβ、GSK-3β、Il-17等表达,结果显示在CHD组中上述蛋白表达同样呈现上调趋势,推测DEL-1可能是通过参与调节炎症通路参与CHD的病变,其作用机制可能是在CHD发生时,导致斑块内DEL-1表达上升,诱导IL-17激活冠脉斑块中GSK-3β/C-EBPβ炎症通路与之对抗,然而GSK-3β/C-EBPβ表现出更强的能力,最终导致炎症反应增强,破坏斑块结构的稳定性,加重了CHD的发展进程,从而引起急性心血管事件的发生。

本研究结果显示,DEL-1参与人冠状动脉粥样硬化的病变演进,DEL-1表达的升高与AS斑块不稳定性发生有关,其机制可能是通过激活GSK-3β/C-EBPβ通路促进炎症反应的发生,证明了DEL-1在中扮演重要作用,本研究结果虽然为DEL-1在CHD猝死中的作用及机制研究提供了人体实验参考依据,但本研究一些不足,比如由于人体标本选自尸检死后案例,受到多种不可控因素的影响,所以下一步本研究将建立动物、细胞模型进行进一步的机制研究。