半硫丸调控AMPK/PPARγ/GPAT3 信号通路对甲减模型大鼠脂质代谢异常的保护作用

曾明星，陈继东，向 楠，邹小娟

［1.湖北中医药大学基础医学院，湖北 武汉 430065； 2.湖北中医药大学第一临床学院，湖北 武汉 430061； 3.湖北省中医院（湖北中医药大学附属医院） 内分泌病科，湖北 武汉 430070］

甲减是临床上常见的内分泌疾病。在我国，甲减的患病率已高达17.8%，甲减可引起低代谢症群，进而引起多脏器和组织损伤，严重威胁身体健康［1］。其中，血脂异常是甲减的常见并发症之一，由此带来的动脉粥样硬化性心血管疾病备受关注［2］； 同时，甲减引起的高胆固醇血症还会增加胆结石形成，引起肝脏脂肪变性，使得ALT/GGT 轻度异常，非酒精性脂肪性肝病风险增加［3］； 甲减还可改变卵巢脂质的含量和相关信号通路，进而影响卵泡的成熟，引起女性不孕的发生［4］。可见，甲减引起的血脂代谢障碍可引起心血管、肝脏、胆囊、生殖等多系统功能障碍，危害性大，需要展开深入研究。

Ma 等［5］研究发现，TSH 可通过与TSHR 结合，抑制AMPKThr172磷酸化，激活PPARγ 转录，进而促进成熟脂肪细胞GPAT3表达，AMPK/PPARγ/GPAT3信号通路可能是甲减合并血脂异常的重要机制之一。甲减合并血脂异常属于中医“瘿劳” “血浊” 病范畴，其中以脾肾阳虚证最为多见［6］。本研究选取具有温肾健脾、化痰通浊功效的经典方剂半硫丸，探讨其对甲减合并血脂异常的作用及其效应机制，以期为临床提供新的治疗方法和思路。

1 材料

1.1 动物 5 周龄SPF 级SD 雄性大鼠，体质量（200±20） g，由三峡大学提供，实验动物生产许可证号SCXK（鄂） 2017-0012，自由饮食，温度20 ～22 ℃，相对湿度50% ～60%，适应性饲养1 周，饲养于湖北中医药大学实验动物中心。本研究经湖北中医药大学实验动物中心动物伦理委员会批准（伦理号HUCMS202009007）。

1.2 药物 半硫丸胶囊，0.5 g/粒，由湖北省中医院药剂科提供，用生理盐水配成3% 混悬液备用； 丙硫氧嘧啶片（规格100 mg，批号31180401，精华制药集团股份有限公司）； 左甲状腺素钠片（规格50 μg，批号241246，德国Merck 公司）。

1.3 试剂 苏木素（美国Sigma 公司，货号H9627）； 伊红Y （水溶性，国药集团化学试剂有限公司，货号71014544）； 大鼠促甲状腺素 （TSH）、游离甲状腺素（FT4）、游离三碘甲状腺原氨酸（FT3） 酶联免疫吸附测定试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，货号EEL-R0976c、E-EL-0122c、E-EL-0079c）； 兔多抗GAPDH（杭州贤至生物科技有限公司，货号AB-P-R001）； 兔多抗GPAT3、PPARγ、p-AMPK （美国Affinity Biosciences 公司，货号Af0485、Af6284、Af3422）； 兔多抗AMPK （英国Abcam 公司，货号Ab131512）； HRP 标记羊抗兔二抗、兔多抗TSHR （武汉博士德生物工程有限公司，货号BA1054、A00576-1）。

1.4 仪器 全自动生化分析仪（美国Rayto 公司，型号Chemray）； 病理切片机（德国Leica 公司，型号RM 2016）；组织摊烤片机（武汉俊杰实业集团有限公司，型号JK-6）；显微镜（日本Olympus 公司，型号BX53）； 微型高速离心机（美国Labnet 公司，型号C2500-R-230V）； 电热恒温培养箱（日本ASONE 公司，型号ICV-450）； 多功能酶标仪（美国Molecular Devices 公司，型号Flex Station 3）； 垂直电泳槽、电转仪 （北京六一仪器有限公司，型号DYCZ-24DN、DYCZ-40）； 实时荧光定量PCR 仪（美国ABI 公司，型号QuantStudio 6）； 水平电泳仪、紫外分析仪（北京君意东方电泳设备有限公司，型号JY300、JY02S）。

2 方法

2.1 造模与分组 将60 只SD 大鼠随机分为正常组（10只），灌胃给予等体积生理盐水； 造模组（50 只），灌胃给予含10 mg/kg 丙硫氧嘧啶片的生理盐水，连续28 d。造模成功后，将模型大鼠随机分为模型组、优甲乐组、半硫丸低剂量组、半硫丸高剂量组和联合用药组（优甲乐联合半硫丸），每组10 只。药物剂量按实验动物与人体表面积比换算，即200 g 大鼠所需剂量相当于成人量×0.018。

2.2 给药 优甲乐组大鼠每天灌胃给予0.04%优甲乐混悬液1.8 mL，半硫丸低、高剂量组大鼠每天分别灌胃给予3%半硫丸混悬液0.9、1.8 mL，联合用药组大鼠每天灌胃给予0.04% 优甲乐混悬液0.9 mL 和3% 半硫丸混悬液0.9 mL，正常组、模型组大鼠灌胃给予等体积生理盐水，持续6 周。

2.3 标本制备 麻醉各组大鼠，经心脏采血，分离血清用于甲状腺功能和血脂检测，每组8 只大鼠断头处死，分别取甲状腺、肾周脂肪，置于－70 ℃保存，用于形态学检查、相关蛋白和mRNA 表达检测。

2.4 ELISA 法检测大鼠甲状腺功能、血脂水平 按照相关试剂盒说明书操作，检测各组大鼠的甲状腺功能相关指标（FT3、FT4、TSH） 和血脂水平（TC、TG、LDL、HDL）。

2.5 HE 染色观察肾周脂肪组织 取相应组织，固定、脱水、包埋、切片、脱蜡、染色，显微镜下观察并拍照。

2.6 RT-qPCR 法检测肾周脂肪组织PPARγ、GPAT3mRNA表达 通过Primer Premier 5.0 软件设计引物，由武汉擎科生物技术有限公司合成，引物序列为PPARγ正向5′-GACATCCCGTTCACAAGAGC-3′，反向 5′-GCTCTTCATGT GGCCTGTTG-3′，产物长度151 bp；GPAT3正向5′-CATCA GTCCAAAGCTCACCA-3′，反向5′-ACAGGGAGCGAACACA GATC-3′，产物长度212 bp。扩增反应条件为50 ℃2 min，95 ℃10 min； 95 ℃30 s，60 ℃30 s，共40 个循环。绘制熔解曲线，数据以2－ΔΔCT法进行分析，计算目的基因的mRNA 相对表达量。

2.7 Western blot 法检测肾周脂肪组织TSHR、p-AMPK、PPARγ、GPAT3蛋白表达 提取大鼠肾周脂肪组织总蛋白，检测蛋白浓度，蛋白通过SDS-PAGE 凝胶电泳分离并转移至PVDF 膜。5%脱脂奶粉溶液封闭2 h，4 ℃下分别加入兔多抗TSHR （1 ∶500）、GPAT3（1 ∶1 000）、PPARγ（1 ∶1 000）、p-AMPK （1 ∶1 000）、AMPK （1 ∶500）、GAPDH （1 ∶1 000） 抗体孵育24 h。用TBST 稀释相应的HRP 标记二抗（1 ∶50 000），使PVDF 膜浸泡于二抗孵育液中，室温摇床孵育2 h，显影、曝光，采用IPP 6.0 分析软件对各组条带进行分析，得到蛋白相对表达量。

2.8 统计学分析 通过SPSS 24.0 软件进行处理，计量资料均符合正态分布且方差齐，数据以（±s） 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD 法。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 半硫丸对甲减大鼠肾周脂肪组织病理形态的影响 与正常组比较，模型组大鼠脂肪滴明显聚集增多； 与模型组比较，各给药组脂肪滴聚集改善； 与优甲乐组比较，半硫丸各剂量组与联合用药组改善更为明显； 与半硫丸低剂量组比较，半硫丸高剂量组效果更好，见图1。

图1 各组大鼠肾周脂肪组织HE 染色（×200）

3.2 半硫丸对甲减大鼠血清FT3、FT4、TSH 水平的影响 与正常组比较，模型组大鼠血清FT3、FT4水平降低（P＜0.01），TSH 水平升高（P＜0.01）； 与模型组比较，优甲乐组和联合用药组大鼠血清FT3、FT4水平升高（P＜0.01），TSH 水平降低（P＜0.01），而半硫丸高、低剂量组改变不明显，没有统计学差异（P＞0.05），见表1。

表1 半硫丸对甲减大鼠血清FT3、FT4、TSH 水平的影响（±s，n＝8）

表1 半硫丸对甲减大鼠血清FT3、FT4、TSH 水平的影响（±s，n＝8）

注： 与正常组比较，∗∗P＜0.01； 与模型组比较，＃＃P＜0.01。

组别FT3/（pg·mL－1） FT4/（pg·mL－1） TSH/（ng·mL－1）正常组39.94±2.5238.16±2.9419.70±5.70模型组20.78±2.66∗∗ 15.26±2.24∗∗ 44.33±10.05∗优甲乐组36.07±1.58＃＃31.75±2.31＃＃24.88±3.86＃＃半硫丸低剂量组 22.41±3.7516.18±3.0040.00±8.72半硫丸高剂量组 25.00±4.3717.14±2.2834.38±9.41联合用药组30.23±3.97＃＃25.77±2.97＃＃29.89±2.34＃＃

3.3 半硫丸对甲减大鼠血清TC、TG、LDL、HDL 水平的影响 与正常组比较，模型组大鼠血清TC、TG、LDL-C 水平升高（P＜0.01），HDL-C 水平无明显变化（P＞0.05）；与模型组比较，各给药组大鼠血清TC、LDL-C 水平降低（P＜0.01），优甲乐组和联合用药组大鼠血清TG 水平降低（P＜0.01），见表2。

表2 半硫丸对甲减大鼠血清TC、TG、LDL、HDL 水平的影响（mmol/L，±s，n＝8）

表2 半硫丸对甲减大鼠血清TC、TG、LDL、HDL 水平的影响（mmol/L，±s，n＝8）

注： 与正常组比较，∗∗P＜0.01； 与模型组比较，＃＃P＜0.01。

组别TCTGLDL-CHDL-C正常组3.07±0.141.80±0.171.10±0.161.57±0.23模型组4.64±0.16∗∗2.25±0.20∗∗2.87±0.08∗∗1.28±0.24优甲乐组3.14±0.17＃＃1.84±0.10＃＃1.24±0.18＃＃1.42±0.28半硫丸低剂量组3.70±0.40＃＃1.99±0.102.07±0.20＃＃1.30±0.14半硫丸高剂量组3.52±0.33＃＃1.86±0.151.90±0.20＃＃1.54±0.32联合用药组3.25±0.11＃＃1.85±0.40＃＃1.55±0.11＃＃1.40±0.12

3.4 半硫丸对甲减大鼠肾周脂肪组织PPARγ、GPAT3mRNA 表达的影响 与正常组比较，模型组大鼠肾周脂肪组织PPARγ、GPAT3mRNA 表达升高（P＜0.01）； 与模型组比较，半硫丸各剂量组和联合用药组大鼠肾周脂肪组织PPARγmRNA 表达降低（P＜0.01），各给药组大鼠肾周脂肪组织GPAT3mRNA 表达降低（P＜0.01），见表3。

表3 半硫丸对甲减大鼠肾周脂肪组织PPARγ、GPAT3 mRNA 表达的影响（±s，n＝8）

表3 半硫丸对甲减大鼠肾周脂肪组织PPARγ、GPAT3 mRNA 表达的影响（±s，n＝8）

注： 与正常组比较，∗∗P＜0.01； 与模型组比较，＃＃P＜0.01。

组别PPARγGPAT3正常组0.98±0.111.01±0.14模型组2.68±0.26∗∗1.84±0.19∗∗优甲乐组2.51±0.131.11±0.11＃＃半硫丸低剂量组2.18±0.18＃＃1.15±0.12＃＃半硫丸高剂量组1.74±0.21＃＃1.15±0.26＃＃联合用药组1.65±0.16＃＃1.16±0.19＃＃

3.5 半硫丸对甲减大鼠肾周脂肪组织TSHR、p-AMPK、PPARγ、GPAT3蛋白表达的影响 与正常组比较，半模型组大鼠肾周脂肪组织TSHR、PPARγ、GPAT3蛋白表达升高（P＜0.01），p-AMPK 蛋白表达降低（P＜0.01）； 与模型组比较，半硫丸各剂量组和联合用药组大鼠肾周脂肪组织TSHR、PPARγ、GPAT3蛋白表达降低 （P＜0.01），p-AMPK 蛋白表达升高（P＜0.01），优甲乐组大鼠肾周脂肪组织GPAT3蛋白表达降低（P＜0.01），见表4、图2。

图2 肾周脂肪组织TSHR、p-AMPK、PPARγ、GPAT3 蛋白条带图

表4 半硫丸对甲减大鼠肾周脂肪组织TSHR、p-AMPK、PPARγ、GPAT3 蛋白表达的影响（±s，n＝8）

表4 半硫丸对甲减大鼠肾周脂肪组织TSHR、p-AMPK、PPARγ、GPAT3 蛋白表达的影响（±s，n＝8）

注： 与正常组比较，∗∗P＜0.01； 与模型组比较，＃＃P＜0.01。

组别TSHRp-AMPKPPARγGPAT3正常组0.32±0.040.63±0.020.10±0.010.31±0.03模型组0.82±0.09∗∗0.17±0.04∗∗0.51±0.04∗∗0.67±0.05∗∗优甲乐组0.74±0.070.22±0.040.48±0.040.33±0.04＃＃半硫丸低剂量组0.66±0.06＃＃0.31±0.04＃＃0.41±0.03＃＃0.47±0.06＃＃半硫丸高剂量组0.54±0.05＃＃0.34±0.04＃＃0.31±0.04＃＃0.52±0.06＃＃联合用药组0.53±0.04＃＃0.39±0.09＃＃0.30±0.03＃＃0.47±0.04＃＃

4 讨论

甲减是继发性血脂异常的常见病因［7］。升高的血脂可以影响内膜厚度，促进高血压发展［8］，严重者可出现心衰［9］。甲状腺激素治疗虽能改善脂代谢状态，但需终生服药，同时也增加了心血管疾病的风险［10］，而中医药在防治甲减及合并症方面具有一定的优势和特色［11］。

甲减属于中医“瘿劳” 病范畴，以脾肾阳虚为主，可夹杂痰湿、瘀血、郁热等变证［12-14］。半硫丸出自《太平惠民和剂局方》，可用于甲减的治疗，疗效颇佳，半硫丸能降低Thc 水平［15］，但具体机制不清。研究发现，敲除TSHR可增加脂肪细胞的大小，减少TSH 诱导的脂解［16］。Ma等［5］研究发现，TSH 与TSHR 结合后，可抑制AMPKThr172磷酸化，激活PPARγ 转录，增加GPAT3表达，增加TG 的生成。本研究发现甲减大鼠血清TG、TC、LDL-C 水平升高，提示甲减合并血脂紊乱［17］。还发现，肾周脂肪组织PPARγ、GPAT3mRNA 基因表达升高，TSHR、PPARγ、GPAT3蛋白表达升高，p-AMPK 蛋白表达降低，提示其存在AMPK/PPARγ/GPAT3信号通路异常表达［5］。

AMPK 激活后通过下调脂肪生成酶，抑制脂肪酸合成，促进游离脂肪酸氧化，减少脂质合成［18］。本研究中甲减大鼠p-AMPK 蛋白表达较正常组降低，AMPK 信号通路被抑制，脂肪酸合成增加，PPARγ 表达上调，进而导致血脂升高。PPARγ 活化后通过参与脂代谢相关基因的调控，抑制脂质代谢。PPARγ 表达升高可能是模型组脂滴过度积聚的原因，半硫丸能抑制PPARγ 的表达，抑制脂滴的积累。综合半硫丸能升高p-AMPK 蛋白表达，降低PPARγ 蛋白表达，推测半硫丸可能是通过激活AMPK 信号通路，下调PPARγ 表达，进而限制脂肪生成，减少脂质合成，起到改善脂质代谢的作用［19］。

特定的GPAT 亚型在不同的细胞中启动甘油三脂的合成［20］，GPAT3主要位于内质网［21］，是一种参与TG 合成的限速酶［22］。在本研究中，模型组脂滴增大，GPAT3表达升高； 经半硫丸给药后，脂滴的数量减少和大小变小，同时GPAT3mRNA 和蛋白表达降低，这可能与半硫丸降低GPAT3表达，减少TG 合成有关。综合半硫丸能升高p-AMPK 蛋白表达，降低PPARγ 的表达，推测随着TSH 水平和TSHR 蛋白表达降低，AMPK/PPARγ/GPAT3通路被抑制，血脂水平随之下降。

综上所述，各药物干预均能有效降低血脂水平，优甲乐和半硫丸均能下调GPAT3mRNA 表达，半硫丸还能下调PPARγmRNA 表达，降低TSHR、PPARγ、GPAT3蛋白表达，升高p-AMPK 蛋白表达； 联合用药组降低TG 的效果与优甲乐组相当，联合用药后还可降低TSHR、PPARγ 蛋白表达，提示半硫丸的加入起到了减量增效作用。因此，半硫丸可能通过多靶点调控AMPK/PPARγ/GPAT3信号通路，在改善甲减合并脂质代谢紊乱中发挥重要作用。