穿心莲内酯自微乳给药系统制备

王冰茜，陈 挺，魏 莉∗

（1.上海中医药大学中药学院，上海 201203； 2.上海智同医药科技有限公司，上海 201203）

穿心莲内酯是从穿心莲中提取得到的一种二萜内酯化合物，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等多种药理活性［1-3］，其水溶性差，属于BCS Ⅱ类成分。前期已有优化穿心莲内酯自微乳给药系统处方的报道，发现该剂型能有效提高原料药溶解度［4-8］，其中油相大多为合成的中、长链甘油三酯类。近年来，有使用松香油［9］、葫芦巴油［10］或薄荷素油［11］制备自乳化系统的研究，这些油相良好的亲脂性使其能溶解BCS Ⅱ、Ⅳ类难溶药物，同时它们还有着理想的生物活性，如抗菌、抗氧化等，在一定程度上减少了相关产品中其他抗氧剂的使用。

广藿香油为广藿香干燥地上部分经水蒸气蒸馏提取得到的挥发油，主要成分为广藿香醇、广藿香酮、广藿香烯等［12］，具有抗炎、镇痛、保护胃肠道、抗氧化等药理作用［13］。中医临床有应用穿心莲与广藿香配伍治疗肠系疾病，并且在葛香感冒胶囊、康乐鼻炎片等制剂中也有使用。本实验以广藿香油为油相制备穿心莲内酯自微乳给药系统，发挥中药挥发油“药辅合一” 的双重作用，以期获得对该成分更好的增溶效果，从而提高其水溶性和生物利用度。

1 材料

1.1 仪器 Waters 2695 型高效液相色谱仪（美国Waters 公司）； ZS-90 型马尔文激光粒度分析仪（英国马尔文仪器有限公司）； IKA 磁力搅拌器［艾卡（广州） 仪器设备有限公司］； 离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）； ZRS-8G 智能溶出试验仪（天津市天大天发科技有限公司）。

1.2 试剂与药物 穿心莲内酯对照品 （批号20210301，湖北慧择普医药科技有限公司，纯度96.12%）。广藿香油（批号20200615，江西恒诚天然香料油有限公司）。油酸乙酯、中碳链脂肪酸甘油酯（MCT）、单辛酸丙二醇酯（CapryolTM90）、单亚油酸甘油酯（MasineTM35-1）、单油酸甘油酯（PeceolTM）、油酸聚乙二醇-6-甘油酯（Labrafil®M1944CS）、辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯（Labrasol®）、乙二醇单乙基醚（Transcutol® HP）均由法国嘉法狮公司捐赠； 聚氧乙烯氢化蓖麻油（Cremophor®RH40） （德国BASF 公司）； 牛磺胆酸钠、鸡蛋卵磷脂、马来酸等缓冲盐（北京索莱宝科技有限公司）。

2 方法与结果

2.1 穿心莲内酯含量测定 采用HPLC 法。

2.1.1 色谱条件 Phenomenex Gemini C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流动相乙腈-水（40 ∶60）； 体积流量1 mL/min； 柱温30 ℃； 检测波长224 nm； 进样量10 μL。

2.1.2 线性关系考察 精密称取穿心莲内酯原料药适量，置于20 mL 量瓶中，甲醇超声溶解定容，得到1 mg/mL 贮备液，吸取适量，甲醇依次稀释至0.003 1、0.006 3、0.012 5、0.025 0、0.050 0、0.100 0、0.200 0 mg/mL，在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y） 进行回归，得方程为Y＝21 228 716X＋15 717 （r＝0.999 9），在0.003 1～0.200 0 mg/mL 范围内线性关系良好。

2.1.3 精密度试验 精密吸取低、中、高质量浓度对照品溶液适量，在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定6 次，测得穿心莲内酯峰面积RSD 分别为0.19%、0.18%、0.15%，表明仪器精密度良好。

2.1.4 重复性试验 平行制备6 份供试品溶液，在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定，测得穿心莲内酯峰面积RSD 为0.45%，表明该方法重复性良好。

2.1.5 加样回收率试验 在一定量空白自微乳中加入不同质量浓度对照品溶液，甲醇制成低、中、高水平 （50%、100%、150%） 供试品溶液，在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，穿心莲内酯平均加样回收率分别为100.32%、99.43%、100.27%，RSD 分别为0.35%，0.94%、0.53%。

2.2 自微乳给药系统辅料筛选

2.2.1 平衡溶解度测定 分别在油相、乳化剂、助乳化剂中加入过量穿心莲内酯，涡旋混匀，37 ℃、150 r/min 振荡平衡72 h，精密量取适量至量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀后测定平衡溶解度，结果见表1。最终确定，以广藿香油为油相，Labrasol ALF、Labrosol、Tween 80 为乳化剂，Transcutol HP 为助乳化剂。

表1 穿心莲内酯平衡溶解度测定结果（n＝3）Tab.1 Results for equilibrium solubility determination of andrographolide （n＝3）

2.2.2 油相与乳化剂配伍 将广藿香油与不同乳化剂分别按1 ∶9、2 ∶8、3 ∶7、4 ∶6、5 ∶5 比例搅拌混合均匀，（1） 取无相分离的混合物1 g，滴入100 倍量37 ℃水中，100 r/min 搅拌，观察乳化情况，分级见表2； （2） 取形成的分散液适量，采用紫外分光光度计在600 nm 波长处测定透光率，结果见表3。

表2 自微乳制剂外观评定分级Tab.2 Appearanceassessmentgradingofselfmicroemulsion formulations

表3 广藿香油与不同乳化剂配伍Tab.3 Compatibilities of Pogostemon cablin oil with different emulsifiers

由此可知，平衡溶解度较高的乳化剂Labrasol ALF 所得分散液澄清度较差，而Tween 80、HS-15、RH 40 所得外观形状理想，但它们对穿心莲内酯的溶解能力均较差，而且Tween 80 在处方分散过程中具有凝胶化现象，乳化缓慢，性质不稳定，受体内环境影响较大，重复性差。综合考虑平衡溶解度与外观澄清度，最终确定将Labrasol ALF 和Tween 80 联合使用。

2.2.3 混合乳化剂配伍 Labrasol ALF 与Tween 80 分别按1 ∶4、1 ∶2、2 ∶3、1 ∶1、3 ∶2、2 ∶1、4 ∶1 比例混匀，再将广藿香油与其分别按1 ∶9、2 ∶8、3 ∶ 7、4 ∶ 6、5 ∶ 5 比例搅拌混匀，按“2.1.2” 项下方法观察乳化情况，测定透光率，并在纳米粒度仪上测定粒径和PDI，结果见表4。

表4 广藿香油与混合乳化剂配伍Tab.4 Compatibilities of Pogostemon cablin oil with mixed emulsifiers

由此可知，当油相占比40%时，ALF 与Tween 80 按2 ∶3～2 ∶1 比例配伍后透光率在80%左右，可明显改善单用ALF 时分散液外观性状； 随着油相占比增加，透光率和粒径有先升后降的趋势，推测其原因可能为广藿香油是混合物，存在天然表面活性剂，可进一步增强乳化效果。

2.2.4Km值筛选 采用直接加水滴定法绘制伪三元相图，固定Labrasol ALF 与Tween 80 比例3 ∶2，将其与助乳化剂分别按Km值4 ∶1、2 ∶1、3 ∶2、1 ∶1、2 ∶3、1 ∶2、1 ∶4 混匀，再与广藿香油分别按1 ∶9 ～9 ∶1 比例混合，边搅拌边连续加入37 ℃超纯水，待溶液澄清透明或伴有蓝色乳光时，准确记录溶液由澄清至浑浊或浑浊至澄清时突变点的加水量，采用Origin 软件绘制伪三元相图，计算阴影部分面积，结果见图1。由此可知，成乳区域较大的Km值比例包括4 ∶1、3 ∶2，其中Km值为4 时乳化剂占比过大，容易引起较明显的胃肠刺激性，故不考虑。

图1 穿心莲内酯自微乳给药系统伪三元相图Fig.1 Pseudo-ternary phase diagrams for andrographolide self-microemulsifying drug delivery system

2.3 处方优化 以广藿香油占比（A）、Labrasol ALF 与Tween 80 比例（B）、Km值（C） 为影响因素，平衡溶解度（Y，测定方法为在搅拌均匀的空白自微乳给药系统中加入过量穿心莲内酯，涡旋混匀，超声助溶后静置12 h 平衡，10 000 r/min 离心10 min，取上清液，甲醇稀释后进样测定） 为评价指标，星点设计-响应面法优化处方，因素水平见表5，结果见表6，方差分析见表7。

表5 星点设计-响应面法因素水平Tab.5 Factors and levels for central composite designresponse surface method

表6 星点设计-响应面法设计与结果Tab.6 Design and results for central composite designresponse surface method

表7 方差分析结果Tab.7 Results for analysis of variance

采用Design-Expert 10.0.1 软件对表6 数据进行拟合，得方程为Y＝7.27－1.29A＋0.12B－2.03C＋0.097AB＋0.62AC＋0.63BC－ 0.32A2＋0.043B2＋0.80C2（R2＝0.958 9），相关系数大于0.9，模型P＜0.05，失拟项P＞0.05，表明该模型可用于预测分析。另外，表7 显示油相占比和Km值有显著影响（P＜0.05），Labrasol ALF 与Tween 80 比例无显著影响（P＞0.05），其原因可能为最初联合应用这2 种乳化剂的目的是改善微乳液外观，使其具有更好的澄清度与更快的乳化时间，而并非改善平衡溶解度。

响应面分析见图2，可知等高线AC、BC呈椭圆形，表明其交互作用显著。以平衡溶解度为指标，得最优处方为广藿香油、Labrasol ALF、Tween 80、Transcutol HP 占比10.45%、13.28%、9.82%、66.44%，平衡溶解度为11.540 9 mg/g。按上述优化处方制备3 批样品，测得平均平衡溶解度为（11.95±0.04） mg/g，与预测值11.540 9 mg/g 接近（相对偏差为3.5%），表明该模型稳定可靠。

图2 各因素响应面图Fig.2 Response surface plots for various factors

2.4 质量评价

2.4.1 粒径、PDI、透光率测定 取3 批样品，37 ℃纯化水稀释100 倍，测得其平均粒径为（51.70±2.91） nm，PDI 为0.27±0.02，乳化时间为（20.22±0.38） s，透光率为（91.21±1.58）%。

2.4.2 稀释倍数对粒径的影响 取自微乳给药系统适量，37 ℃纯化水分别稀释5、10、20、50、100、200、400 倍，测定其平均粒径、PDI、透光率，并观察其室温放置12 h 后有无沉淀或相分离，结果见表8，可知在一定范围内随着稀释倍数增加，粒径逐渐减小，均在100 nm 以内，符合自微乳给药系统要求。另外，人体空腹状态下胃中的平均液体量为45 mL，服用0.5 g 左右自微乳给药系统时被稀释100 倍左右，粒径符合要求。

表8 稀释倍数对粒径的影响（n＝3）Tab.8 Effect of dilution times on particle size（n＝3）

2.4.3 分散介质对粒径的影响 分别以纯化水、盐酸（pH 1.2）、磷酸盐缓冲液 （pH 5.5、6.8、7.2） 为分散介质，将自微乳给药系统稀释100 倍，测定其粒径、PDI，结果见表9。

表9 分散介质对粒径的影响（n＝3）Tab.9 Effect of dilution medium on particle size （n＝3）

2.4.4 冻融稳定性考察 取自微乳给药系统适量，在－20 ℃下冷冻24 h 后37 ℃水浴解冻24 h，反复3 次，纯化水稀释100 倍，测定其粒径、PDI，结果见表10。由此可知，冻融循环后自微乳给药系统粒径增加，但仍符合要求。

表10 冻融稳定性考察结果（n＝3）Tab.10 Results for freeze-thaw stability investigation（n＝3）

2.4.5 体外溶出研究 取自微乳给药系统适量，按照2020 年版《中国药典》 四部通则0931 第二法桨法，量取溶出介质900 mL，设定温度为（37.0±0.5）℃，转速为100 r/min，从接触溶出介质时开始计时，于5、10、20、30、45、60、90、120 min 各取10 mL，补充等温等体积磷酸盐缓冲液（pH 6.8），0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，结果见图3。由此可知，自微乳给药系统溶出速率明显提高，5 min 内即溶出完全，而原料药2 h 内累积溶出度仍低于60%。

图3 穿心莲内酯体外溶出曲线（n＝3）Fig.3 In vitro dissolution curves for andrographolide（n＝3）

2.5 动态溶解度研究

2.5.1 空腹状态模拟肠液制备 参考文献［14-15］ 报道，配方为牛磺胆酸钠3 mmol/L、鸡蛋卵磷脂200 μmol/L、氯化钠68.62 mmol/L、马来酸19.12 mmol/L，氢氧化钠调节pH 至6.5，即得。

2.5.2 测定方法 取过量穿心莲内酯原料药，置于37 ℃空腹状态模拟肠液中，150 r/min 超声分散均匀，于5、15、30、45、60、120、180、240、300、360 min 各取2.5 mL，0.45 μm 微孔滤膜过滤，续滤液稀释后进样分析，测定动态溶解度。取空白自微乳给药系统适量，按1 ∶100 比例分散于37 ℃空腹状态模拟肠液中，150 r/min 搅拌均匀后加入过量原料药，于5、15、30、45、60、120、180、240、300、360 min 各取2.5 mL，0.45 μm 微孔滤膜过滤，续滤液稀释后进样分析，测定动态溶解度。取相当于平衡溶解度100%的自微乳给药系统0.5 g，加到50 mL 37 ℃空腹状态模拟肠液中，150 r/min 搅拌均匀，于5、15、30、45、60、120、180、240、300、360 min 各取2.5 mL，0.45 μm 微孔滤膜过滤，续滤液稀释后进样分析，测定动态溶解度。将上述数据导入Graphpad Prism 软件，绘制时间-动态溶解度曲线，见图4。由此可知，上述3种样品溶解度分别为 0.047、0.062、0.119 mg/mL，表明自微乳给药系统可明显提高原料药在空腹状态模拟肠液中的溶解度，并且能在6 h内维持相对稳定的1.92 倍过饱和度。

图4 穿心莲内酯时间-动态溶解度曲线（n＝3）Fig.4 Time-dynamicsolubilitycurvesfor andrographolide （n＝3）

3 讨论

本实验根据穿心莲内酯在辅料中的平衡溶解度筛选增溶效果良好的辅料，以粒径、透光率等指标进行单因素试验以获得乳化能力更佳的辅料，在确保能形成自乳化体系、制剂外观理想的基础上，采用星点设计-响应面法优化处方，并进行质量评价。结果，所制备的穿心莲内酯自微乳给药系统平衡溶解度较文献［16-17］ 报道的提高2 倍左右，但由于大多数自微乳最终剂型为软胶囊，故该制剂平衡溶解度尚未达到临床常用单剂量需求（50 mg/粒），其原因可能为（1） 穿心莲内酯在油相、乳化剂（或助乳化剂） 中溶解度差异很大，导致开发高剂量的自乳化制剂非常困难； （2） 穿心莲内酯在不同pH 缓冲液饱和正丁醇中的LogP为1.5 左右（文献［4，18］ 报道为1.55 ～2.63），LogP在0 ～3 范围内亲脂性适中，而广藿香油主要成分广藿香醇为4.7 左右，即两者脂溶性有所差异。

另外，过饱和药物递送系统属于热力学不稳定状态，沉降（析出） 是其生物药剂学性质的潜在不利因素［19］。本实验探索了在100%载药情况下自微乳给药系统中穿心莲内酯溶解度，发现它能在6 h内维持该载药下的过饱和度。