油莎豆快速繁殖体系构建研究

王晓龙， 钟 鹏 ， 杨 曌， 柴 华， 李莎莎， 徐艳霞， 吴 玥， 高海娟，王宏伟 ， 王建丽， 李 伟， 王若丁， 孙 蕊， 李 莉， 张 杨

（1.黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院，黑龙江齐齐哈尔 161005；2.通辽市农牧科学研究所，内蒙古通辽 028000；3.黑龙江省农业科学院草业研究所，黑龙江哈尔滨 150086）

油莎豆（Cyperus esculentus）又名油莎草，是莎草科多年生草本植物， 原产于非洲地中海地区， 自20 世纪50 年代由北京植物园从苏联将油莎豆种质资源首次引入我国， 在我国常作一年生作物栽培（李佳婷等，2019）。 油莎豆块茎富含油脂，是适宜沙地生长的草类，喜温暖湿润气候环境，其适应性强，具有抗旱、耐涝、耐贫瘠且耐盐碱等特性，其地上茎叶营养丰富，含粗脂肪（7.6% ～9.1%）、糖（10.6%）、粗蛋白质（9.8%）和粗纤维（19.3%）等（Bai 等，2021；陈星，2013），其是集粮、油、饲为一体，具有较高综合利用价值的作物，是家畜和家禽十分喜爱的饲料（李变变等，2023；RazolaDíaz 等，2022）。 油莎豆以块茎繁殖，近几年来，随着我国种植业结构的调整，油莎豆从2017 年（2.4×103hm2）至2019 年（13.3×103hm2）种植面积迅猛增加，其在新疆、内蒙古、吉林、河南、黑龙江等地区均有栽培（杨向东和李子勇，2022）。

我国油莎豆种质资源遗传多样性较低，现存优良品种十分匮乏， 加之油莎豆种植在我国气候环境下一般不开花或开花不结实， 因此采用常规杂交育种方法培育优良新品种比较困难（马紫薇等，2022；阳振乐，2017），大多只能以块茎繁殖，而长期用其繁殖，易出现品种退化、品质降低、带菌严重等问题。 植物组织培养技术手段是加快植物繁殖及获得无菌植株的行之有效方法， 可实现优良品种的种质创新及种苗规模化生产， 该项技术目前已在农作物如马铃薯（Solanum tuberosum）、 甘薯 （Dioscorea esculenta）、蒜（Allium sativum）等生产上得到广泛应用（杨寻，2021； 冯光惠等，2015； 王鹏等，2015；赵彦杰，2006）。 但关于油莎豆茎尖组织培养及快速繁殖技术的研究却较少且不成熟， 限制了油莎豆种植推广和种质资源创新。 因此，本研究选取油莎豆茎尖作为外植体，MS 作为基础培养基， 通过以添加不同比例的生长调节剂来进行茎尖分化诱导及生根诱导， 进而构建油莎豆种质快速繁殖体系， 为寒区高效繁育油莎豆优异种苗及种质资源创制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料 试验材料为黑油莎2 号油莎豆，种子由黑龙江省农业科学院提供。化学试剂6-苄基腺膘呤（6-BA）、吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）和吲哚丁酸（IBA）由福晨（天津）化学试剂有限公司提供。 MS 和1/2MS 培养基，由青岛高科技工业园海博生物技术有限公司提供。

1.2 试验方法

1.2.1 最佳茎尖消毒方法选择 油莎豆种子消毒后，放入恒温水浴锅中35 ℃浸泡24 h，之后置于27 ℃环境温度下催芽。 待顶芽长至1 ～2 cm 时，用解剖刀切下顶芽，设置不同的消毒处理（75%酒精30 s+0.1%升汞消毒时间分别设定为A1=3 min、A2 =4 min、A3 =5 min、A4 =10 min、A5 =15 min），每个处理30 株，3 次重复，消毒后用无菌水冲洗6 次，置于无菌纸上吸干顶芽表面水分，将顶芽置于双目解剖镜下，用解剖刀切取茎尖（1 ～2 mm）分生组织，接种于顶芽诱导培养基（MS+1.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA+30.0 g/L 蔗糖+7.0 g/L琼脂，pH 5.8），培养室温度为25 ℃，光照14 h/d，黑暗10 h/d， 光强150 μmol/m2·s，20 d 后统计污染数量、死亡数量和存活数量，并计算污染率、成苗率。

污染率/%=（污染外植体数量/外植体总个数）×100；

存活率/%=（存活外植体数量/外植体总个数）×100。

1.2.2 茎尖分化培养基筛选 将消毒后的茎尖，放置于双目解剖镜下，用解剖刀切取茎尖（1 ～2 mm）分生组织，接种于不同激素配比的培养基上（表1），每个处理接种50 个茎尖，3 次重复，培养室温度为25 ℃，光照14 h/d，黑暗10 h/d，光强为150 μmol/m2·s，20 d 后统计污染数、死亡数、成苗数，计算成苗率：

表1 茎尖分化培养基

成苗率/%=（成苗外植体个数/外植体总个数）×100。

1.2.3 快速繁殖与生根培养基筛选 将分化的茎尖，接种于不同激素配比的快速繁殖培养基上，处理为MS+6-BA（0.8、1.0、1.2 mg/L），每个处理接种30 株，3 次重复。

将快速繁殖培养基中小苗（2 ～3 cm）接种于生根培养基上，1/2MS 培养基中添加不同浓度激素（IBA、IAA 和NAA，表2），每个处理接种30 苗，3 次重复，20 d 后统计生根数及根系形态，计算生根率：

表2 无菌苗生根培养基

生根率/%=（生根外植体个数/外植体总个数）×100。

1.3 数据统计 采用Excel（2010）处理数据，用Sigma Plot（12.5）作图，采用SAS（9.0）软件对数据进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 黑油莎2 号茎尖消毒 由图1 可知，黑油莎2 号茎尖污染率为15.56% ～44.44%； 死亡率为12.22% ～53.33%；存活率为31.11% ～67.78%。随消毒时间的增加， 黑油莎2 号茎尖污染率呈现降低的趋势，死亡率呈现升高趋势，而存活率则呈现先升后降的变化。 0.1%升汞消毒3 min 时即A1，黑油莎2 号茎尖污染率显著高于其他消毒处理（P＜0.05）；A2（消毒4 min）时，黑油莎2 号茎尖存活率显著高于其他消毒处理（P＜0.05），且呈现峰值，分别是A1（3 min）、A3（5 min）、A4（10 min）、A5 （15 min） 处理的1.65、1.38、1.90、2.17 倍；A5（消毒15 min）时，黑油莎2 号茎尖死亡率显著高于其他消毒处理（P＜0.05）。 此结果表明，75%酒精30 s+0.1%升汞消毒4 min 时黑油莎2 号茎尖消毒效果最好。

图1 消毒方法与效果比较

2.2 黑油莎2 号茎尖分化培养 由图2 可见，在不同激素处理中黑油莎2 号茎尖污染率为8.67% ～31.33%； 死亡率为28.67% ～65.33%； 成苗率为18.00% ～62.67%。其中B2 处理时，黑油莎2 号茎尖分化成苗率呈现最高值， 显著高于其他处理（P＜0.05）， 其次是B3 和C2， 分别为34.67%、34.33%，A1 和A2 较低。 在B2、D1、D2 处理时，黑油莎2 号茎尖污染率量较低， 分别为8.67%、10.00%、11.33%，显著低于其他处理（P＜0.05）。以上结果表明， 在MS 培养基中加入0.9 mg/L 6-BA 和0.3 mg/L NAA 时， 黑油莎2 号茎尖诱导分化成苗效果最优。

图2 不同激素对黑油莎2 号茎尖分化的影响

2.3 黑油莎2 号快速繁殖培养 由图3 可知，6-BA 为1.0 mg/L 即A2 时，黑油莎2 号无菌苗死亡率为6.67%，显著低于A2 和A3 处理（P＜0.05），此时A2 黑油莎2 号无菌苗分化率呈现最高值，为94.33%， 与A1 和A3 处理相比增加12.11%和16.55%， 且A2 黑油莎2 号无菌苗分化率显著高于A1 和A3 处理（P＜0.05）。 以上结果表明，MS培养基中加入1.0 mg/L 6-BA 可显著提高黑油莎2 号无菌苗的繁殖速率。

图3 不同6-BA 浓度对黑油莎2 号无菌苗快繁的影响

2.4 黑油莎2 号生根培养 由表3 可见，在1/2MS培养基上添加不同浓度的IBA、NAA 和IAA 时生根率差异较大，A2 时， 黑油莎2 号无菌苗生根数量（29.00）最高，显著高于其他处理（P＜0.05），生根率为96.67%，且根系粗壮，根长为0.9 ～3.0 cm，而IAA 培养基中， 黑油莎2 号无菌苗生根率为62.22% ～ 83.33% ，NAA 生根率为42.22% ～62.22%，明显低于IBA 和IAA 处理。该结果表明，黑油莎2 号最佳生根培养基为1/2MS 培养基添加0.2 mg/L IBA，此培养基不仅生根率高，而且根系粗壮、不易褐化。

表3 不同激素对黑油莎2 号生根的影响

3 讨论

植物组织培养是选取植物某个部位（组织、细胞、器官）为外植体，在人工可控的无菌环境下，利用富含植株生长发育所需养分的培养基中培养，在激素调控下使其发育成完整植株（张慧君和陈劲枫，2015）。其中茎尖培养也称分生组织培养，由于茎尖顶端分生组织携带病毒较少， 所以应用茎尖脱毒培养技术是行之有效的方法。研究表明，通过营养块茎、 球茎等繁殖的植物如马铃薯、 山药（Rhizoma dioscorea）、半夏（Pinellia ternata）、荸荠（Eleocharis dulcis）等，传统繁殖方式不仅扩繁速度慢，消耗种茎多，而且长期块茎无性繁殖易积累病毒， 因而利用组织培养进行离体快繁是当前应用最广泛的一种快速繁育种苗及优化种质的技术（陈芝华等，2018；靳松等，2017；冯光惠等，2015；陈利萍，2009）。其中，外植体消毒是本试验中的最关键步骤， 消毒效果不佳， 将直接导致培养基污染， 并对试验结果的统计造成影响。 培养基污染主要有人为因素和外植体引发， 而外植体本身携带大量的细菌和真菌， 只能通过寻找合适的消毒试剂、 适宜的药剂浓度及严格的消毒时间来降低污染。 油莎豆块茎长于地下，其表面布满细菌，甚至部分细菌已进入到块茎内部， 因此选择适宜的消毒方法将其彻底消毒尤为关键。本研究中，75%酒精结合0.1%升汞消毒4 min 时，黑油莎2 号茎尖存活率最高， 随消毒时间延长或缩短均影响消毒效果，这与黄思（2015）的研究结果趋于一致，但与吴琼（2007）用0.2%升汞消毒的结果却不尽相同，这可能是品种不同或消毒部位不同所引起的，究其原因， 可能是由于0.1%升汞中的汞离子（Hg+） 进入细菌细胞后主要与酶或蛋白质上的巯基（-SH）结合而使之失活或变性，因此0.1%升汞更适宜油莎豆茎尖消毒。 同时消毒时长也会影响外植体消毒效果， 消毒时间过长造成外植体不可逆损伤，时间过短则外植体消毒不彻底，所以掌控好消毒时间也是外植体消毒的关键（黄思，2015）。

植物生长和发育过程是源于分生组织不断进行分裂、分化而成。 植株在早期阶段胚形成以后，其顶端生长点随着种胚的萌发生长， 起初形成茎尖分生组织，之后又逐渐分化成初生分生组织，最后形成地上部分如茎和叶（陆维超等，2016；韩德元，1997）。而在茎尖的分化过程中，植物茎尖分生组织的形态特征、 理化特性以及内源激素含量都会发生变化（张慧君和陈劲枫，2015）。 因此，外源植物激素的种类、 水平及组合对植物组织的分化和增殖显得十分重要。 细胞分裂素是植物组织培养过程中促进组织分化和生长的物质， 不同细胞分裂素种类及浓度对组培苗的分化增殖效果不同（陆维超等，2016）。 本研究中， 随6-苄基腺膘呤（6-BA）浓度增加，黑油莎2 号茎尖分化成苗率表现为先升后降的变化， 试验确定了黑油莎2 号茎尖分化最佳浓度为6-BA 0.9 mg/L，此时诱导产生的茎尖分化速度最快， 分化成苗率最高， 植株健壮，这与黄思（2015）的研究结果基本一致，说明细胞分裂素正向调控茎尖分生组织的细胞分化，并能控制分生组织的大小和分化速度。 而6-BA 浓度（0.9 mg/L）一定时，黑油莎2 号茎尖分化的最佳萘乙酸（NAA）浓度为0.3 mg/L，当NAA 浓度高于或低于该浓度，成苗率呈现明显降低，而陈利萍（2009）却指出，NAA 0.1 mg/L 是较为理想的诱导培养基激素配比，本研究结果与其有所不同，这可能与材料本身的遗传特性及取材大小有关， 由此说明适宜生长素浓度能加快茎尖细胞分裂活动，对茎尖分生组织的分化起到促进作用， 而生长素浓度高于特定阀值（最适浓度）时，则对茎尖分化具有抑制作用（陆维超等，2016）。 本研究中，MS+1.0 mg/L 6-BA 可明显提高黑油莎2 号无菌苗繁殖速率，这与黄思（2015）的研究结果相一致，而瞿萍梅等（2007）则认为，MS+0.5 mg/L 6-BA 培养基的继代增殖效果更好， 这可能与供试品种的遗传特性及基因型不同有关（李佳婷等，2019）。 此外，从生根培养的诱导方面可以推测出， 不用植物或同一植物不同品种间的差异导致茎尖分化苗的生根难易程度不同。 韩晓勇等（2013）研究指出，1/2MS+0.2 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+0.02%活性炭培养基为铁棍山药生根培养最适培养基， 平均生根天数为12 d，生根率100%，根系最长为1.04 cm；张振霞等（2016）研究发现，1/2MS+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L 吲哚丁酸（IBA）培养基为广山药的最佳生根培养基配方，主根性状明显，出现较多的不定根和毛状根。 目前对于油莎豆的组织培养研究报道很少，本研究中，黑油莎2 号茎尖分化苗在1/2MS 培养基上生根，1/2MS+0.2 mg/L IBA 为快速生根培养基配方， 该培养基黑油莎2 号再生苗生根率为96.67%，这与瞿萍梅等（2007）的研究结果相一致，说明尽管品种不同，但最适宜生根培养基激素配比基本相同， 可见油莎豆芽诱导生根对激素种类具有一定的依赖性。 油莎豆快速繁殖体系构建不仅缩短了茎尖分化诱导时间， 而且提高了无菌苗生根率， 为油莎豆优质种苗高效繁育奠定基础。

4 结论

本试验结果表明：（1）黑油莎2 号最佳茎尖消毒方法为75%酒精30 s+0.1%升汞4 min。 （2）最优茎尖分化培养基成分为MS+0.9 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA。 （3） 最佳快速繁殖培养基配方为MS+1.0 mg/L 6-BA。 （4）最佳生根培养基配方为1/2MS+0.2 mg/L IBA。