响应面法优化柞蚕蛹虫草活性肽提取工艺研究

刘博佳， 李正钰， 柳叶飞， 王 泽，5， 徐方旭

（1.沈阳师范大学生命科学学院，辽宁沈阳 110034；2.沈阳师范大学粮食学院，辽宁沈阳 110034；3.沈阳师范大学实验教学中心，辽宁沈阳 110034；4.辽宁省功能性蛹虫草重点实验室，辽宁沈阳 110034；5.沈阳市功能性蛹虫草产业技术研究院，辽宁沈阳 110034；6.辽宁省蛹虫草种质资源库，辽宁沈阳 110034）

活性肽在自然界中广泛存在并且具有多种生理活性（黄静雅等，2020），可改善人们的健康状况，用于疾病的预防及治疗，例如免疫调节、增强骨密度、降血脂等（钱磊等，2016；李勇等，2010）。 因此，活性肽是筛选药物、制备保健食品、食品添加剂以及疫苗的天然资源（李亚洁等，2020；李晶等，2014；张胜等，2010），在生物医药及保健食品领域具有广阔的应用前景 （Xian 等，2021；Liu 等，2020；Wang等，2018；孙亚男等，2017；刘洁等，1997）。

活性肽是蛋白质的功能活性片段， 可以提供生长发育所需营养元素， 其跟蛋白质比起来有独特的生理活性特点。活性肽由于体积小、在体内使用率高而有着良好的健康推动作用。近几年，日本和英国等国家已用活性肽功能因子开发出各种美妆类产品和老年人食品等系列产品， 并取得良好的反馈，增加了社会和经济效益。

柞蚕蛹虫草富含蛋白质（都兴范等，2021），是制备活性肽的首选材料。 但由于缺少产品精深加工，无法有效提高柞蚕蛹虫草相关产品的附加值。目前， 以菌菇类为材料制备活性肽的研究已有较多报道（张芳艺等，2023；熊川等，2019；刘果等，2017），制备方式方法也很多，其中酶解法因具有工艺成熟、副产物生成少、专一性好、人体容易吸收等优势而备受关注。 本文主要对柞蚕蛹虫草蛋白的酶解条件进行优化（张禹等，2021； 芦鑫等，2018；马淑慧等，2017），旨在提供一种高效的柞蚕蛹虫草蛋白酶解方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 供试材料：柞蚕蛹虫草由沈阳师范大学特种菌业研究所提供。

主要试剂：硫酸铜，酒石酸钠钾，盐酸，氢氧化钠，硫酸，蒽酮，碱性蛋白酶，胰蛋白酶。

双缩脲试剂配制： 溶解1.5 g 硫酸铜和6.0 g酒石酸钾钠于500 mL 去离子水中， 在搅拌下加入300 mL 的10%氢氧化钠溶液， 用水稀释到1 L，贮存于内壁涂以石蜡的瓶中备用标准牛血清蛋白溶液配制： 用0.05 mol/L 的氢氧化钠溶液配制浓度为5 g/L 的牛血清蛋白溶液。

1.2 仪器与设备 ESJ-182 型电子天平购自中国沈阳市龙腾电子有限公司；TG1650-W 型高速离心机购自上海卢湘怡离心机仪器有限公司；CS-Ⅲ型高纯水发生仪购自经纬分析仪器有限责任公司；SB25-12 型超声波清洗机购自宁波新芝生物科技技术股份有限公司；H-H 型数显恒温水浴锅购自金坛金城国胜实验仪器厂；UV-5100 型紫外分光光度计购自上海元析仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 柞蚕蛹虫草蛋白质的制备 柞蚕蛹虫草干品置于55 ℃烘箱中，待完全烘干后称取100 g 样品加入1000 mL 水浸泡0.5 h，捞出后挤干水分剁碎，再放入之前用来浸泡的1000 mL 水中，温火煮1 h 后用纱布过滤。重复2 次，再用多层纱布过滤，浸提液定容至1 L 备用。

用0.1 mol/L 的NaOH 溶液将上述浸提液pH调至10.0。浸提1 h，6000 r/min 离心15 min，取上清液，再用0.1 mol/L 的HCl 将上清液pH 调至等电点，静沉1 h，待沉淀析出后，6000 r/min 离心15 min，得到蛋白质沉淀。 将沉淀调至中性后进行冷冻干燥制得柞蚕蛹虫草蛋白粉， 保存到离心管中备用。

1.3.2 单因素试验设计 在预试验基础上筛选结果，选取最佳的酶组合（碱性蛋白酶+胰蛋白酶），从加酶量、酶解时间、酶解pH 和反应温度四个因素进行考察， 确定四个因素对柞蚕蛹虫草蛋白液酶解程度的影响。

1.3.3 响应面优化试验 在单因素试验结果的基础上，采用Design Expert 10 Box-Behnken 试验设计方案，以酶解时间（A）、加酶量（B）、pH（C）和反应温度（D）为影响因素，以多肽得率为响应值，设计四因素三水平的响应面试验（王元川等，2023；金司阳等，2023）， 优化柞蚕蛹虫草活性肽的提取工艺（郑冰姝等，2021；张睿，2015），响应面试验因素与水平设计详见表1。

表1 响应面试验因素与水平设计

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 加酶量对多肽得率的影响 由图1 可知，当底物一定时， 多肽得率随加酶量的增加呈先升高后下降最终趋于平缓的趋势。 当加酶量达到2%时，多肽得率最大，为75%。随着酶量的继续增加在2% ~ 2.5%时， 多肽得率呈下降趋势， 降至60%之后， 尽管酶量继续增加， 多肽得率稳定在60%左右。 因此2%的加酶量为最佳比例。

图1 加酶量对多肽得率的影响

2.1.2 反应温度对多肽得率的影响 由图2 可知，从总体上看，在一定的温度变化范围内，多肽的得率随温度的升高而升高，当温度达到55 ℃时多肽提取率最高，为50%。 当温度高于55 ℃后，多肽得率有轻微下降的趋势，但差异较小。通过酶的相关特性可知， 当温度过高时会影响酶的活性，导致转化率降低，所以推测高于55 ℃后的下降趋势是因此产生。 所以，确定多肽提取的最佳温度为55 ℃，并将55 ℃作为响应面试验设计的中心点。

图2 反应温度对多肽得率的影响

2.1.3 反应时间对多肽得率的影响 由图3 可知，酶解时间达2 h 的多肽得率最高，为55%。 短于或长于这个时间， 多肽的得率均低于55%，由图可明显看出，随着时间的继续延长，多肽得率呈下降趋势，当酶解时间到6 h 后，多肽得率基本平稳，在45%左右轻微波动。 因此，应选择2 h 作为最佳酶解时间。

图3 酶解时间对多肽得率的影响

2.1.4 pH 对多肽得率的影响由图4 可知，多肽得率随pH 的增加呈先增加后减少的趋势。 pH为7 ～8 时多肽得率稳定在48%左右，当pH 继续升高到9 后，此时多肽得率最高，达到55%。 pH升高到10 时，多肽得率仍稳定在55%。 而后，随着pH 的继续升高，多肽得率开始下降。 因此，pH在9 ～10，均是可选择的最佳酶解pH。

图4 pH 对多肽得率的影响

2.2 响应面优化试验分析 采用Box-Behnken设计方法，以多肽得率为评定指标，分别进行29组试验， 采用Design-Expert 10 软件对数据进行响应面回归拟合，响应值（Y）和各因子（A、B、C、D） 之间的二次回归模型为：Y=83.52-0.63A-0.87B-8.95C+2.57D-17.88AB+3.57AC+16.55AD-1.48BC +4.55BD +6.3CD -17.54A2-14.01B2-15.21C2-13.26D2。 回归模型方差分析见表2。

表2 响应面试验方差分析

失拟项P 值为0.1726＞0.1， 表明二次模型拟合程度较好， 能准确反映不同条件对柞蚕蛹虫草多肽得率的影响。模型系数分析表明，预测值与实际值之间误差较小，一次项对模型具有显著性影响（P＜0.05），根据F 值可知，试验各因素对柞蚕蛹虫草多肽得率影响的强弱顺序依次为：pH＞加酶量＞反应温度＞酶解时间。

2.3 响应面交互作用分析 利用Design-Expert 10 软件绘制四个因素交互作用对柞蚕蛹虫草多肽提取率影响的响应图。 由图5 可知，pH、酶解时间、反应温度和加酶量对多肽得率的影响均显著，其中，pH 对多肽得率的影响最为显著。 通过对响应面坡度， 等高线密度以及性状等多方面对比分析四种因素对柞蚕蛹虫草多肽得率的影响顺序为：pH＞酶解时间＞反应温度＞加酶量。

图5 四因素对多肽得率影响的响应面图

2.4 最佳提取工艺的确认与验证 根据响应面软件得出的数据分析可知， 柞蚕蛹虫草蛋白液最优酶解条件为：酶解时间2.81 h、加酶量2%、pH 9.77、反应温度56.04 ℃。考虑到试验的可操作性，调整最佳酶解条件为： 酶解时间2.8 h、 加酶量2%、pH 9.7、反应温度56 ℃。 按照修正条件进行三次平行试验进行验证， 测得柞蚕蛹虫草多肽得率平均值为86.1%，与预测值87.52%接近，表明最佳提取条件下提取的多肽得率比较稳定， 该模型能较好地预测辅助提取柞蚕蛹虫草活性肽。

3 结论

本试验在单因素试验的基础上， 对柞蚕蛹虫草蛋白的提取条件采用响应面法进行优化。 结果表明， 柞蚕蛹虫草蛋白的最优提取条件为酶解时间2.8 h、加酶量2%、pH 9.7、反应温度56 ℃。 在此条件下， 提取的多肽得率为86.1%， 与预测值87.52%接近，说明该条件下提取的柞蚕蛹虫草多肽得率较高，该模型具有较好的预测性，可为今后柞蚕蛹虫草产业化开发应用提供依据。