南酸枣叶原花青素的提取工艺优化及抗氧化活性研究

张 强， 渠淑洁， 戴 航

（广西中医药大学药学院公共卫生管理学院，广西南宁 530299）

南酸枣又名广枣，在我国主要分布在江西、广西、广东、湖南、湖北、浙江、福建和贵州等地（尧云萍等，2021），目前也有人工育种种植（黄文辉等，2022）。 南酸枣的果实和树皮都可以入药（黄雨佳等，2021）， 南酸枣果实中含有营养成分和生物活性物质（Zeng 等，2019），如蛋白质、多糖、氨基酸、维生素、有机酸和酚类物质等，树皮和树叶中含有黄酮类化合物及苷类（周剑等，2017）。南酸枣果核具有醒酒、杀虫作用，可以与一些植物合用，制成蚊香；树皮具有抑菌、止血作用，树叶具有明目作用，在医学、食品等领域有很大的应用前景。 聂韡等（2022）发现，南酸枣果皮提取物的有较好的抗过敏功效。

原花青素含有酚羟基，具有抗癌、抗肿瘤、降血糖和预防心血管疾病等活性（杨博，2011），可用于治疗白内障、 干眼症和视网膜类疾病（李春阳等，2004）。 原花青素具有抗氧化能力、 自由基清除能力和抗衰老能力，且其毒副作用低，生物利用度高，可以用于化妆品和保健品的制作中（胥鑫萌等，2021）。 蒋彤等（2021）通过HPLC-MS 鉴定了南酸枣果皮含16 个原花青素成分。 南酸枣收货后，叶子掉落后会当做肥料或者自然处理后遗弃，造成了大量资源浪费。南酸枣自然资源丰富，从南酸枣叶子中提取原花青素， 可为天然来源的抗氧化剂开发提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 南酸枣叶来源于南宁植物园。试验所用试剂种类及来源见表1。

表1 试验用试剂

1.2 仪器 试验用仪器设备及来源见表2。

表2 试验用仪器设备

1.3 试验方法

1.3.1 样品准备 将清洗干净的南酸枣叶，于110 ℃烘干24 h 至恒重，用粉碎机粉碎，过20 目筛，得南酸枣叶干粉备用。南酸枣叶原花青素提取步骤如下： 称取南酸枣叶粉末一定量于磨口锥形瓶中，按一定液固比加入丙酮，置于预定温度的超声波振荡器中提取，提取结束后将提取溶液2000 r/min 离心20 min，取上清液，进行旋转蒸发后，得到原花青素粗提物，贴好标签，备用。

1.3.2 紫外光谱 以甲醇为参比溶液， 把浓度为0.12 mg/mL 的南酸枣叶原花青素提取物进行紫外扫描，确定其最大吸收波长。

1.3.3 绘制标准曲线 取一定量儿茶素标准品，加入甲醇溶剂溶解后， 将其配制成标准溶液母液。配制浓度为0.04 ～0.20 mg/mL （间隔0.02 mg/mL）的标准溶液各5.0 mL。 配制0.04 g/mL 香草醛-甲醇溶液。 取香草醛-甲醇溶液5.0 mL，各系列浓度标液3.0 mL， 盐酸1.0 mL， 混合于10 mL容量瓶，甲醇定容到10 mL，置于暗处反应1 h。于500 nm 测定吸光值，记录数值，并作标准曲线。

1.3.4 样品含量的测定 取一定量的南酸枣叶原花青素粗提物放置于烧杯中，溶解后定容（甲醇溶液）， 参照1.3.3 的试验方法测定南酸枣叶原花青素得率。 根据标准曲线方程求出待测液中的原花青素含量， 然后求出1.0 g 南酸枣叶样品中原花青素物质的含量（以儿茶素计，mg/g）。

1.3.5 单因素试验 原花青素的提取中， 丙酮-水提法提取率最高（余修亮等，2018），可能是由于花青素中的酚羟基容易与丙酮的C=O 形成缔合作用（李春阳等，2004）。因此本试验采用丙酮作为提取溶剂。

1.3.5.1 时间对南酸枣叶原花青素得率的影响取1.0 g 南酸枣叶样品粉末于锥形瓶中， 按液固比1:20 加入丙酮（70%）20 mL，于40 ℃分别提取4、6、8 min 和10 min。 结束后将提取液离心后旋蒸，得南酸枣叶原花青素粗品，备用，依据1.3.4 步骤计算原花青素得率。

1.3.5.2 料液比对南酸枣叶原花青素得率的影响取1.0 g 南酸枣叶样品粉末于锥形瓶中， 按液固比1:15、1:20、1：25 和1:30 加入丙酮（70%），于40 ℃超声提取8 min。 结束后将提取液离心后旋蒸，得南酸枣叶原花青素粗品，备用，依据1.3.4 步骤计算原花青素得率。

1.3.5.3 温度对南酸枣叶原花青素得率的影响取1.0 g 南酸枣叶样品粉末于锥形瓶中， 按液固比1:20 加入丙酮（70%）20 mL，分别在30、35、40、45、50 ℃超声提取8 min。结束后将提取液离心后旋蒸，得南酸枣叶原花青素粗品，备用，依据1.3.4步骤计算原花青素得率。

1.3.5.4 丙酮浓度对南酸枣叶原花青素得率的影响 称取1.0 g 南酸枣叶粉末于磨口锥形瓶中，设定超声温度为45 ℃， 按料液比1:20 加入体积分数为50%、60%、70%、80%和90%的丙酮进行试验，超声提取8 min。 结束后对提取液离心，浓缩后得南酸枣叶原花青素粗提取物， 备用， 依据1.3.4 方法进行定量分析。

1.3.6 正交试验设计 在单因素试验的基础上，选择超声时间、料液比、超声温度、丙酮浓度4 个因素，以南酸枣叶原花青素的得率作为考察指标，设计正交试验。 因素水平见表3。

表3 正交试验因素水平

1.3.7 南酸枣叶原花青素的抗氧化活性

1.3.7.1 南酸枣叶原花青素对超氧自由基清除能力 将4.5 mL Tris-HCl 溶液30 ℃保温15 min，之后加入1 mL 梯度浓度的南酸枣叶原花青素溶液和0.4 mL 25 mmol/L 的邻苯三酚溶液，上下振荡摇匀，之后在30 ℃保温5 min，加入1 mL 浓度为8 mol/L 的氯化氢终止反应，然后在325 nm 处测定吸光度（A1），空白以蒸馏水代替样品液，测定吸光度（A0）。 Vc 作为阳性对照进行试验，并按照下列公式计算样品对超氧阴离子自由基的清除率：

取不同浓度的南酸枣叶原花青素提取物0.1 g，称取坏血酸0.1 g，蒸馏水溶解，定容25 mL，此溶液为母液。 分别从原花青素和坏血酸母液中移取不同体积的溶液，用10 mL 容量瓶进行定容，配成一系列浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、4 mg/mL的样品液，备用。分别配制三氯乙酸、三氯化铁、铁氰化钾溶液。 移取铁氰化钾2 mL、磷酸缓冲溶液3 mL 和不同浓度样品液2 mL，定容至25 mL，混合均匀，在50 ℃水浴加热30 min，稍冷，依次加入2.5 mL 三氯乙酸和2 mL 三氯化铁，定容。在700 nm处进行测定，记录数据。

1.3.7.2 南酸枣叶原花青素清除DPPH 自由基的研究 参考王晴晴等（2017）的方法测定南酸枣叶原花青素对DPPH 的清除效果，以空白样对仪器进行校准。 分别取梯度浓度的南酸枣叶原花青素溶液2.0 mL 溶液于试管中，之后用移液器加浓度为0.04 mg/mL 的DPPH 2 mL， 于暗处放置300 min后在517 nm 测定吸光度（A1）； 以无水乙醇代替DPPH，按照上述方法测定吸光度（A2）；空白组按上述方法测定吸光度（A0），Vc 作为阳性对照进行试验， 并按照下列公式计算样品对DPPH 自由基的清除率：

1.3.7.3 南酸枣叶原花青素清除羟基自由基的研究 称取0.1 g 南酸枣叶原花青素提取物和0.1 g坏血酸，用蒸馏水溶解，定容25 mL，此溶液为母液。 配制浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、4 mg/mL的南酸枣叶提取液。 移取2 mL 的水杨酸乙醇溶液（6 mmol/L），2 mL 的硫酸亚铁溶液（6 mmol/L）和2 mL 的不同浓度的样品溶液， 最后移取2 mL的双氧水溶液（6 mmol/L），定容到25 mL，水浴30 min（37 ℃），于526 nm 下测定，吸光度值记为A1， 以纯水代替样品时溶液的吸光度值记为A2，不加双氧水时的溶液作为空白。

1.4 数据处理 所有结果均表示为 “平均值±标准偏差”（±SD），并采用SPSS 20.0 软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 标准曲线图

2.1.1 全波长扫描 由图1 可知， 最大吸收波长λmax为500 nm。

图1 全波长扫描图

2.1.2 标准曲线图 南酸枣叶原花青素所得的标准曲线如图2 所示， 横轴表示的是溶液的浓度（mg/mL），纵轴表示的是溶液吸光度A，线性方程式为：y=1.77317x-0.00845，R2=0.9973， 由其线性方程式可知，在浓度为0.06 ～0.2 mg/mL，原花青素线性关系良好。

图2 标准曲线图

2.2 单因素试验结果

2.2.1 时间对南酸枣叶原花青素得率的影响 从图3 可知，在4 ~ 8 min 内，南酸枣叶原花青素得率与时间呈正相关关系， 在8 min 时提取率达到最大，继续延长时间，南酸枣叶原花青素的提取率有所下降。 可能是因为超声时间过长破坏南酸枣叶原花青素部分结构。因此，将正交优化范围确定为6 ~ 10 min。

图3 时间对南酸枣叶原花青素得率的影响

2.2.2 料液比对南酸枣叶原花青素得率的影响如图4 所示，随着液料比的增加，南酸枣叶原花青素的提取率呈上升趋势，而液料比为1：20 时；南酸枣叶原花青素的得率最大；后面继续增大样品的液料比，南酸枣叶原花青素的得率呈下降趋势。 可能是后面有其他杂质溶出，与南酸枣叶原花青素的溶出形成竞争关系，使得原花青素的得率降低。因此，将料液比正交优化范围确定为1/15~1/25。

图4 料液比对南酸枣叶原花青素得率的影响

2.2.3 温度对南酸枣叶原花青素得率的影响 如图5 所示，在30 ～45 ℃，南酸枣叶原花青素得率随温度升高而增加；在温度超过45 ℃，南酸枣叶原花青素得率呈下降趋势，可能由于温度较高时，原花青素有分解情况发生， 且丙酮挥发变强。 因此，将温度的正交优化范围确定为40 ~ 50 ℃。

图5 温度对南酸枣叶原花青素得率的影响

2.2.4 丙酮浓度对南酸枣叶原花青素得率的影响如图6 所示，在丙酮体积分数为0.5 ～0.7，南酸枣叶原花青素得率随体积分数升高而增加； 在丙酮体积分数为0.7 时， 南酸枣叶原花青素得率达12.35 mg/g，之后有所下降，可能由于丙酮浓度高时，其他成分溶出也增加，使得原花青素溶出相对变少。因此，将丙酮体积分数的正交优化范围确定为0.6 ~ 0.8。

图6 温度对南酸枣叶原花青素得率的影响

2.2.5 南酸枣叶原花青素正交试验 依照正交设计原理和单因素试验结果，选取超声时间（A）、料液比（B）、温度（C）和丙酮体积分数（D）四个因素，采用四因素三水平L9（34）正交试验对南酸枣叶多酚的提取进行优化，结果见表4。

表4 正交试验优化结果

由表4 分析可得，超声时间、料液比、温度和丙酮体积分数对超声波辅助提取南酸枣叶原花青素的顺序次第为温度（C）＞丙酮体积分数（D）＞料液比（B）＞超声时间（A），丙酮超声辅助提取的最佳工艺条件为A2B3C2D2，即超声时间8 min、料液比1：25、温度45 ℃、丙酮体积分数0.7。在该条件下进行三次平行试验， 南酸枣叶多酚得率为16.59、16.71 mg/g 和16.86 mg/g，平均得率为16.85 mg/g，试验结果具有较高的稳定性和可靠性。

2.3 抗氧化活性研究

2.3.1 南酸枣叶原花青素的超氧自由基清除能力由图7 可知， 南酸枣叶清除超氧自由基的能力随浓度增加呈增大趋势，在0.1 ～0.5 mg/mL 浓度下，清除能力快速上升， 之后趋于平缓， 在浓度为2 mg/mL 时对超氧自由基清除率可达75%。 在相同浓度条件下， 南酸枣叶原花青素对超氧自由基的清除能力弱于VC。

图7 南酸枣叶原花青素对超氧自由基的清除能力

2.3.2 南酸枣叶原花青素对DPPH 清除能力 由图8 可知，在0.5 ～1.5 mg/mL 内，南酸枣叶原花青素对DPPH 的清除能力随浓度增加而增强。 在1.5 ～3.0 mg/mL， 南酸枣叶原花青素对DPPH 的清除能力趋于稳定。 结果表明南酸枣叶原花青素对DPPH 有清除作用，但弱于VC。 南酸枣叶原花青素对DPPH 自由基的IC50为0.83 mg/mL。

图8 南酸枣叶原花青素清除DPPH 自由基能力

2.3.3 南酸枣叶原花青素对羟基自由基清除能力由图9 可知，在浓度0.5 ～2.0 mg/mL 内，南酸枣叶原花青素对OH 的清除能力随浓度增加较快，在2.0 ~ 3.0 mg/mL 增加缓慢而趋于稳定。 表明南酸枣叶原花青素对OH 有一定的清除作用， 但弱于VC，其对OH 自由基的IC50为1.5 mg/mL。

图9 南酸枣叶原花青素清除羟基自由基能力

3 结论

试验通过超声辅助法提取南酸枣叶原花青素，考察了提取时间、料液比、温度和丙酮浓度对得率的影响， 结合正交试验设计对提取工艺进行了优化。 结果显示： 南酸枣叶原花青素超声辅助法最佳条件为超声时间8 min、料液比1∶25、温度45 ℃、丙酮体积分数0.7。 该条件下，原花青素得率可达16.85 mg/g。 抗氧化试验测试表明，南酸枣叶原花青素对超氧自由基、OH 和DPPH 自由基有一定的清除能力， 其中对DPPH 和OH 自由基IC50分别为0.83 mg/mL 和1.50 mg/mL。 说明南酸枣叶原花青素有较好的抗氧化活性。