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不同品种马驹粪便菌群多样性及丰度的分析研究

2024-03-11马玉辉李婷婷樊振声叶斯哈提提安奴尔兰阿克亚孜奴尔旦别克居尼西别克

中国饲料 2024年5期
关键词:伊犁马马驹哈萨克

马玉辉, 李婷婷, 樊振声, 叶斯哈提·提安,奴尔兰·阿克亚孜, 奴尔旦别克·居尼西别克, 李 海

(1.昭苏县西域马业有限责任公司,新疆昭苏 835600;2.昭苏县畜牧兽医发展中心,新疆昭苏 835600;3.新疆农业大学动物科学学院,新疆肉乳用草食动物营养实验室,新疆乌鲁木齐 830052)

动物胃肠道微生物是消化道重要组成部分,与宿主互利共生,维持胃肠道内环境的稳态(朱伟云等,2014)。 幼龄草食家畜胃肠道微生物细菌种类、数量、丰度及多样性相对于成年家畜较低,但随着幼龄动物月龄的变化呈增加趋势,至断奶细菌的种类和数量达到接近母畜的比例。 微生物细菌感染、定植易受品种、饲养管理和日粮营养水平等影响而产生差异(张瑞阳等,2022;马露等,2019)。 这种差异影响断奶期草食动物(牛、羊及马)对日粮的消化利用,特别是对日粮纤维的降解率。 马是单胃草食家畜,其盲肠和结肠相当于反刍动物(牛和羊)的瘤胃,进行复杂的微生物发酵过程,对粗饲料具有较强的消化能力。 不同品种的马驹因饲养管理、日粮组成等差异导致肠道中微生物组成、结构、丰度等不同,对断奶期日粮改变的适应能力不同。因此,了解和丰富断奶期马驹肠道微生物细菌的多样性、组成和丰度,对通过微生物调控马驹肠道健康,缓解断奶应激具有重要的意义。 因此,本研究以3 个品种(哈萨克马、伊犁马、纯血马)断奶期马驹为研究对象, 通过分析粪便中细菌多样性和丰度指标,揭示不同品种马驹断奶期肠道微生物细菌组成等的差异, 为不同品种马驹断奶期丰富肠道微生物、缓解断奶应激等提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验时间与地点 试验于2021 年10 月在新疆伊犁昭苏县进行。

1.2 试验动物 选择15 匹6 月龄断奶的伊犁马、 哈萨克马和纯血马马驹, 平均体重分别为(145.28±1.69)、(126.75±5.58)kg 和(184.65±9.54)kg,每个品种各5 匹。

1.3 试验设计 以品种为单位进行分组,分别为伊犁马断奶马驹组、 哈萨克马断奶马驹组和纯血马断奶马驹组, 断奶前一天通过直肠采集马驹粪便样品,测定相关指标。

1.4 采样期前饲养管理 伊犁马和纯血马马驹与母马在同一环境下饲养,试验马匹每日09:00、15:00和21:00 饲喂饲草料,母马自由采食粗饲料(苜蓿和牧草2∶1 混合饲喂),精料补充料3 kg/(d·匹);马驹自由觅乳,采食与母马相同的粗饲料,每天精料补充料0.65 kg/(100 kg·BW)。哈萨克马马驹处于放牧条件下,马驹自由摄取母乳,自由采食牧草和自由饮水。 早晨09:00 饲喂前将马驹和母马分开,使用马驹专用料兜每天补喂精料补充料0.65 kg/(100 kg·BW)。 所有马匹按照章程,使用伊维菌素(Ivermectin)驱虫剂进行驱虫,按照体重0.2 mg/kg的剂量口服。 精料补充料组成及营养水平见表1。

表1 精料补充料组成及营养水平(干物质基础)%

1.5 样品采集 在采样当天, 将马驹绑定后,用75%的酒精对其肛门周围进行消毒, 通过直肠采集马驹粪便,将采集的马驹粪便收集于收粪瓶中,混合均匀, 液氮速冻, 最终将采集的所有粪便样品-80 ℃冷冻保存。

1.6 样品测定 马驹粪便细菌总DNA 的提取、PCR 扩增、Illumina HiSeq 测序及结果分析均由北京诺禾致源生物信息科技有限公司协助完成。 最终结果以稀释后的基因组DNA 为模板,使用16S rDNA 的V3 ~V4 区特异引物515F 和806R 进行PCR 扩增。 515F:5′-GTTTCGGTGCCAGCMGCCGCGGTAA -3′ ;806R:5′ -GCCAATGGACTACHVGGG-TWTCTAAT-3′。

1.7 数据处理 在Excel 中先将数据进行预处理,再使用SPSS 18.0 软件进行单因素方差分析,采用Duncan 氏法进行各组之间多重比较, 试验结果均以“平均值±标准差”(Mean±SD)表示。

2 结果

2.1 不同品种马驹粪便中细菌Alpha 多样性分析 由表2 可知,observed_species 结果显示哈萨克马马驹粪便中观测到的物种值指数极显著高于伊犁马马驹和纯血马马驹, 分别提高了28.72% (P< 0.01) 和 54.76% (P< 0.01);goods_coverage 各品种马驹之间差异不显著(P>0.05); 哈萨克马马驹和纯血马马驹PD_whole_tree 指标极显著高于伊犁马马驹,分别提高了67.04%(P<0.01) 和53.99%(P<0.01); 哈萨克马马驹粪便中细菌ACE 和Chao1指数极显著高于伊犁马马驹和纯血马马驹(P<0.01), 分别提高了37.29%、61.36%和84.78%、116.78%;Shannon 和Simpson 指数各品种马驹之间差异不显著(P>0.05)。

表2 不同品种马驹粪便中细菌Alpha 多样性

2.2 不同品种马驹粪便中细菌丰度分析

2.2.1 门水平不同品种马驹粪便中细菌丰度 由表3 结果可知, 各品种马驹粪便中细菌门水平前10 的物种中,相同的有7 个物种,分别是厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门、疣微菌门、放线菌门、软壁菌门和螺旋体门。 其中伊犁马和纯血马马驹粪便厚壁菌门丰度极显著高于哈萨克马马驹, 分别提高63.50%(P<0.01) 和70.37%(P<0.01);拟杆菌门各品种之间差异极显著,哈萨克马>纯血马>伊犁马;变形菌门,哈萨克马马驹极显著高于伊犁马和纯血马马驹(P<0.01);软壁菌门伊犁马马驹极显著高于哈萨克马和纯血马(P<0.01);疣微菌门、 放线菌门和螺旋体菌门3 个品种之间差异不显著(P>0.05)。 此外,伊犁马马驹粪便中还检测出黏胶球形菌门和蓝藻菌门; 哈萨克马马驹和纯血马马驹粪便中检测出纤维杆菌门和广古菌门,但差异不显著(P>0.05)。

表3 门水平不同品种马驹粪便中细菌丰度

2.2.2 科水平不同品种马驹粪便中细菌丰度 由表4 可知,科水平马驹粪便前10 的物种中,相同的菌有瘤胃球菌科、 毛螺旋菌科和克里斯滕森菌科, 纯血马马驹粪便中瘤胃球菌科丰度比哈萨克马显著提高195.61%(P<0.05);毛螺旋菌科纯血马显著高于伊犁马和哈萨克马(P<0.05),分别提高63.81%和100.90%;克里斯滕森菌科伊犁马极显著高于哈萨克马和纯血马(P<0.01)。 伊犁马和哈萨克马粪便中检测到乳杆菌科, 但差异不显著(P>0.05);伊犁马和纯血马粪便中检测到莫拉菌科,但差异不显著(P>0.05);链球菌科和理研菌科在哈萨克马和纯血马粪便中检测到, 但是差异不显著(P>0.05)。 此外,伊犁马马驹粪便中检测到肉杆菌科、Family_XIII、葡萄球菌科和丹毒丝菌科;哈萨克马驹粪便中检测到甲烷粒菌科、普氏菌科、螺旋体科和阿克曼氏菌科;纯血马马驹粪便中检测到unidentified_Clostridiales、芽孢杆菌科和明串珠菌科。

表4 科水平不同品种马驹粪便中细菌丰度

2.2.3 属水平不同品种马驹粪便中细菌丰度 由表5 可知,属水平前10 的物种中3 个品种相同的细菌有链球菌属,其中哈萨克马和纯血马马驹粪便中的丰度显著高于伊犁马(P<0.05),分别提高了200.48%和811.53%。 伊犁马和纯血马马驹粪便中相同的菌属是不动杆菌属,伊犁马和哈萨克马相同的菌属是乳酸菌属,哈萨克马和纯血马相同的菌属是甲烷粒菌属和梭菌属。 此外,伊犁马马驹粪便中还检测到德库菌属、奇枝菌属、Christensenellaceae_R-7_group、Ruminococcaceae_NK4A214_group、Eotgalicoccus、Mogibacterium 和肉食杆菌属;哈萨克马驹检测到阿克曼氏菌属、肠杆菌属、琥珀酸弧菌属、拟杆菌属、纤维杆菌属和Spirochaetaceae;纯血马马驹检测到Spirochaetaceae、嗜冷芽孢杆菌属、魏斯氏菌属、节细菌属、Saccharofermentans和毛螺旋菌属。

表5 属水平不同品种马驹粪便中细菌丰度

3 讨论

肠道菌群是一个复杂的多微生物生态系统,对维持和促进人和动物的健康具有极其重要的作用(谢强等,2017)。马驹肠道菌群随月龄和日粮组成的改变而发生变化。 马驹从4 月龄开始至6 月龄逐渐进入断奶期, 日粮从母乳—母乳+固体饲料—全固体饲料进行转化(宗学阳等,2022)。2 月龄左右的马驹已经开始跟随母马尝试采食固体饲料,因此,在断奶前大部分马驹已经能够适应固体日粮。日粮组成、结构类型等的改变是影响马驹胃肠道菌群变化的主要原因之一 (Sakaitani 等,1999)。因此,马驹在断奶前肠道菌群结构组成、多样性等与母马已经有一定的相似性。 Kuhl 等(2011)报道,马驹出生后4 周龄时肠道菌群结构与母马的高度相似。 Earing 等(2012)通过凝胶电泳技术测定发现,出生后42 d 的马驹粪便细菌的条带与母马相似性很高。 也有研究显示, 出生后30 d 的马驹粪便微生物没有显著变化,而出生后60 d 粪便菌群结构相对稳定,到9 月龄大时与母马粪便菌群结构仍有一定的差异(Costa 等,2016;Faubladier 等,2014)。 基于研究间的差异,无法得出关于微生物区系稳定的时间点和断奶效果的结论。然而,肠道菌群组成的主要变化似乎发生在出生后的前几个月,即断奶之前。 因此,研究断奶期马驹肠道菌群多样性、结构、组成及丰度对深入研究断奶后马驹肠道微生物区系的变化、 日粮消化利用以及马驹健康等具有重要的意义。

Costa 等(2016)研究结果显示,马驹(夸特马)出生至270 d 粪便菌群多样性呈不同的变化特点。出生第1 天马驹粪便中OTUs 为1893.25,Simpson为106.67;马驹出生后第121~180 天的断奶期OTUs 为1716.19,Simpson 为90.39,物种值和多样性指数呈降低趋势。这可能与新生马驹胃肠道细菌单一、数量少,出生后随着与母马、母乳及周围环境的接触, 迅速感染大量微生物, 导致马驹OTUs 和Simpson 增加有关。 随着马驹月龄的增加,马驹逐渐适应周围养殖环境和饲粮,通过肠道的适应以及微生物调节代谢, 逐渐形成相对稳定的微生态环境, 使肠道菌群变化相对较稳定, 因此,OTUs 和Simpson 有所降低。 Lindenberg 等(2019)研究结果显示, 马驹(纯血马) 出生到断奶后, 通过测定Chao1、 观察物种和Shannon 指数确定的Alpha 多样性稳步增加。 随着时间的推移,Alpha 多样性在所有指标上都有稳定的增加。最明显的是在出生后第20~50 天。 在断奶前和断奶后采集的样本之间没有显著差异。因此,马驹出生至断奶期间,粪便菌群多样性的变化因月龄、品种、饲养管理及日粮等产生差异。 本研究结果显示,在断奶期哈萨克马驹粪便中有显著的Alpha 多样性, 特别observed_species、PD_whole_tree、ACE 和Chao1 极显著高于其他两个品种。一方面这种差异可能与马驹品种有关,另一方面可能与3 种马驹采样前饲养管理和日粮组成有关。 Harlow 等(2016)研究发现,日粮中淀粉的来源不同导致马匹肠道菌群存在差异。本研究中,伊犁马和纯血马马驹是舍饲饲养,日粮由苜蓿干草、牧草干草和精料补充料组成;哈萨克马驹放牧条件下补喂精料补充料,这种饲粮结构的差异可能是导致马驹肠道细菌Alpha 多样性呈现显著性差异的根本原因。

Costa 等(2016)研究结果表明,随着马驹月龄的增加, 组成马驹粪便菌群前10 的物种丰度发生显著性的变化。 因此,月龄的变化可能是导致马驹肠道菌群丰度改变的根本原因。马驹月龄变化除了马驹体重、体尺、消化能力、免疫机能等变化外,更多的可能是马驹饲养管环境和日粮的改变(饲料种类、采食量、消化率等),从而导致不同月龄段菌群的差异。 在马驹出生后121~180 d,粪便中门水平前10 的菌种均有厚壁菌门、 变形菌门、unclassified、疣微菌门、拟杆菌门、放线菌门、螺旋体门、纤维杆菌门、Acidobacteria 和Chlamydiae (Costa 等,2016)。厚壁菌门是马驹此阶段主要的菌种。纤维杆菌门和螺旋体门极显著高于其他月龄段马驹。本研究中门水平前10 的菌种与Costa 等(2016)研究结果相似,但是3 个品种之间存在较大的差异。 3 个品种相同菌中,厚壁菌门是伊犁马和纯血马马驹粪便中主要优势菌,虽然哈萨克马排在第一的优势菌也是厚壁菌门, 但是丰度极显著低于其他两个品种。 而拟杆菌门在哈萨克马粪便中的丰度达到了29.39%,极显著高于其他两个品种。 这种差异主要受3 个品种日粮组成和饲养环境的影响较大。研究显示(Quercia 等,2019;Jost 等,2013;Yu 等,2011;Fraga 等,2008;Crowell-Davis 等,1985), 马驹出生早期肠道微生物可能受母马产道和母乳的影响较大,随着日粮摄入的增加,日粮的组成可能是改变马驹胃肠道微生物种类和丰度变化的关键因素。本研究中3 个品种在科和属水平前10 的菌种相同的细菌种类很少,科水平有3 种,属水平仅有1 种,这种差异更加说明了品种之间差异的原因。 此外,3个品种的马驹饲养在同一地区不同的养殖环境,这也说明养殖环境可能是导致这种差异的另一原因(Lindenberg 等,2019)。 肠道菌群的稳定时间不仅与潜在的日粮干预有关,马驹的健康状况在一定程度上也会影响肠道菌群发生变化(Lindenberg 等,2019;Fouhy 等,2012)。 例如,哺乳期马驹热腹泻与肠道微生物的变化有关,这表明马驹腹泻可能容易受到饮食干预的影响, 影响其肠道微生物菌群(Lindenberg 等,2019;Fouhy 等,2012)。 此外,马驹通常要接受抗生素治疗和驱虫等,用药过程也是影响马驹肠道菌群变化原因(Fouhy 等,2012)。 本研究中,3 个品种马驹粪便菌群在门、 科和属水平上存在较大的差异,是品种、日粮、饲养管理及健康状况等众多因素共同作用的结果,要进一步说明品种之间差异根本原因, 可能要通过研究消除多因素,在单一因素条件下进行深入研究来进行解答。

4 结论

在本研究条件下,3 个品种马驹中哈萨克马粪便细菌多样性显著性最高; 厚壁菌门、 拟杆菌门、变形菌门、疣微菌门、放线菌门等是3 个品种门水平相同的优势菌; 在科水平和属水平3 个品种马驹细菌组成和丰度差异较大, 具体原因需要进一步深入研究。

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