不同被毛颜色成年斯布牦牛生长性能比较及分子育种潜力分析

朱 勇， 阮鹏程， 俄广鑫， 信金伟， 张 强， 陈晓英，曹涵文， 姜 辉， 鲜莉莉， 陆东祥， 张成福

（1.省部共建青稞和牦牛种质资源与遗传改良国家重点实验室，西藏拉萨 850002；2.农业农村部青藏高原畜禽遗传育种重点实验室，西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所，西藏拉萨 850009；3.西南大学动物科学技术学院，重庆 400716）

斯布牦牛是青藏高原型牦牛的地方类群之一，其主产区为西藏自治区拉萨市墨竹工卡县，群体数量1 万余头（姜辉等，20221）。 斯布牦牛被毛以黑褐色为主，少有棕色和灰色，是西藏地区公认的三大优良牦牛品种之一（姬秋梅等，2000）。 当今， 斯布牦牛仍是产区牧民重要的资源和生产资料， 对牧区百姓脱贫增收和牦牛产业的提质增效具有十分重要的意义。

近些年， 相关科研单位对斯布牦牛种质利用与健康养殖开展了系列研究。 廖阳慈等（2018）研究发现， 斯布牦牛全舍饲条件下补饲可显著提高冬春季牦牛的日增重和饲料转化效率。另外，姜辉等（2021） 利用安格斯与斯布牦牛进行杂交生产F1 代安犏且杂种优势明显， 特别是在F1 代6 ~12 月龄体重上显著高于斯布牦牛。 然而F1 代犊牛哺乳能力不佳、 毛绒质量差等不适于高海拔天然放牧饲养。 这说明杂交改良虽有助于提高后代生长性能， 但无法稳定遗传亲本中牦牛良好的高原生态适应力。所以，充分发挥牦牛在产区独有的环境适应性优势基础上， 加快本品种选育步伐是我国牦牛产业提质的关键。

当前针对斯布牦牛，主要聚焦于饲养管理（邓由飞等，2013）、营养需求（廖阳慈等，2018）、绒毛品质 （姬秋梅等，2004）、 肉品质特征 （牛珺等，2017）与屠宰副产物活性物质（张玉卿等，2015）研究等。然而，对斯布牦牛生物学特性及育种潜力挖掘尚不充分。 本研究拟以墨竹工卡县斯布牦牛核心选育场（保种）群体为研究对象，开展不同被毛颜色（黑色和棕色）类群成年生长性能分析，描述斯布牦牛种群生长曲线，同时，鉴定已明确与牦牛重要经济性状相关遗传标记在斯布牦牛群体内的优势基因型频率， 为今后探索斯布牦牛适时出栏技术， 评估其分子育种潜力并为后续斯布牦牛分子选育提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 生长性能测定与分析 斯布牦牛生长性能测定在西藏自治区拉萨市墨竹工卡县斯布牦牛选育场（东经91°71’70”，北纬29°60’26”）开展。 以91 头全棕色及60 头黑色斯布牦牛为测定对象，测定前24 h 禁食，6 h 禁水。

依据《斯布牦牛》（DB54/T0071-2013）标准对成年斯布牦牛进行生长性能测定， 测定指标包括体重、体高、体斜长、胸围及管围。 测定数据以“平均值±标准差”表示，组间单因素方差分析检验利用SPSS 软件计算，P＜0.05 和P＜0.01 为显著性及极显著性差异判定阈值。

1.2 重要经济性状相关遗传标记基因型检测于斯布牦牛选育场， 利用真空采血针分别采集棕色斯布牦牛96 头及黑色斯布牦牛60 头尾静脉全血样本，每头约5 mL。全基因组DNA 利用吉恩生物DNA 提取试剂盒（吉恩生物，中国）提取，1%琼脂糖凝胶电泳用于检测基因组DNA 提取质量，Nan0-400A （美国） 超微量核酸分析仪用于检测DNA 提取浓度。

参考张强等（2022）报道的5 个已知牦牛重要经济性状显著相关遗传标记的分型引物信息，由武汉天一华煜基因科技有限公司（武汉，中国）合成引物。 聚合酶链式反应（PCR）扩增体系包括：5 μL BioMed 2iTaq PCR Mix（北京博迈德基因技术有限公司， 北京），1.0 μL 的上下游引物混合液，全基因组DNA 50 ng，超纯水补足至10 μL。 PCR扩增程序为：96 ℃预变性7 min；95 ℃变性40 s，52 ℃退火40 s，72 ℃延伸80 s，35 个循环；72 ℃终延伸10 min。 PCR 产物交由武汉天一华煜基因科技有限公司（武汉）完成后续SNaPshot 反应，并使用ABI3130XL（美国）测序平台开展基因分型。

利用Microsatellite Toolkit 宏文件执行各遗传标记基因型数据编辑及相关遗传参数统计， 包括多态信息含量（PIC）、观察杂合度（HO）和期望杂合度（HE）等。 群体内各位点的哈代温伯格平衡（HWE）检验利用Arlequin 3.5 软件评估（Schneider，2010）。

2 研究结果

2.1 不同被毛颜色斯布牦牛成年生长性能 由表1 可知， 斯布牦牛在5 ～7 岁龄其黑色与棕色群体在体重、体斜长与胸围之间无显著差异（P＞0.05）。 黑色群体在6、7 岁龄的体高极显著 （P＜0.01）高于棕色群体，尤其是黑色群体的管围在这三个年龄阶段均显著 （P＜0.05） 或极显著 （P＜0.01）高于棕色斯布牦牛。 值得注意的是，尽管黑色群体的各项体尺指标优于棕色群体且体重无显著差异， 但棕色群体在三个岁龄的体重均值均高于黑色群体，5、6、7 岁棕色与黑色斯布牦牛体重比分别为106.1%、108.5%、108.2%。

表1 不同被毛颜色斯布牦牛成年生长性能比较

2.2 不同被毛颜色斯布牦牛群体内重要经济性状候选标记基因型频率

2.2.1 黑色斯布牦牛群体内5 个牦牛重要经济性状候选标记基因型频率 由表2 可知， 黑色斯布牦牛群体中ACSL1-A2079T 位点基因型T/T 的频率最高 （70.0000%）， 基因型A/A 的频率最低（1.6667%）， 等位基因A 和T 的频率分别为15.83%和84.17%。 而棕色群体内ACSL1-A2079T位点基因型A/A 的频率最高（60.4167%），基因型T/T 的频率最低（6.2500%），等位基因A 和T 的频率分别为77.08%和22.92%。 其次，ACSL1-G2409A 位点G/G 基因型在两个群体内均为最高，分别为81.6667%（黑色）和68.7500%（棕色）。MyoD1-C1710T 位点的杂合基因型G/A 在黑色（56.6667%）与棕色群体（46.8750%）内均为最高频率基因型。两个群体内的TMEM-18-C1267T 和TMEM-18-C4447T 位点的G/G 基因型频率均为最高， 分别为70.0000%（黑色） 及70.8333%（棕色），而A/A 型频率最低。

表2 黑色斯布牦牛群体内5 个牦牛重要经济性状候选标记基因型频率

2.2.2 棕色斯布牦牛群体内5 个牦牛重要经济性状候选标记基因型频率 由表3 可知， 两个群体中各位点遗传多样性分析结果显示，MyoD1-C1710T 在所有位点中期望杂合度最高， 分别为0.5020（黑色）和0.4960（棕色），而最低为黑色群体的ACSL1-G2409A （0.1679） 和棕色群体的TMEM-18-C4447T （0.2651）。 在两个群体中PIC指标最高的是MyoD1-C1710T，分别为0.3739（黑色） 和0.3717 （棕色）。 其中ACSL1-G2409A、TMEM-18-C1267T 和TMEM-18-C4447T 在两个群体内均为低度多态位点 （PIC＜0.25），MyoD1-C1710T 在两个群体内均为中度多态位点（0.25≤PIC＜0.5）。 HWE 分析结果显示，各位点在两个斯布牦牛类群中均为发生哈代温伯格平衡显著偏离（P＜0.05）。

表3 棕色斯布牦牛群体内5 个牦牛重要经济性状候选标记基因型频率

3 讨论

毛进彬等（2020）研究证实，牦牛从出生到成年其个体的体尺与体重变化随年龄的增长遵循“前快后慢”的发育规律。 本研究通过对两种不同被毛颜色的斯布牦牛成年个体的各阶段体尺与体重比较发现， 尽管黑色群体较棕色个体的体尺指标在某些阶段略佳， 但棕色牦牛的体重却更有优势。 Keys 等（2014）研究表明，体重指标比体高等体尺指标更加优先适合于判定肥胖程度。 陈玲等（2023）、董静超等（2021）、王志明等（2016）均从事关于家养动物体尺与体重的通径分析及最优回归模型建立研究。然而，诸多结果显示最终推演的体重-体尺最优回归模型差别迥异， 这可能不仅由于畜种及品种不同， 而且受到体尺和体重测定方法与指标类别差异的影响。特别是，在同一品种及技术指标基本一致条件下，裴杰等（2017）、刘更寿等（2016）、罗海青等（2016）、王伟（2012）的研究结论存在差异。 这可能是手动测定体尺数据受人为及动物体态等诸多因素影响而难以保证统一性和准确性。本研究发现，棕色牦牛成年各阶段体重平均值略优于黑色类群，并未与体尺呈正相关，提示不同被毛颜色的牦牛群体可能不仅是外观表型的差异，同时存在体型上不同的结构发育特征。后续将通过屠宰性能测定等多方面研究加以明确棕色斯布牦牛成年体重优势特征的生理基础。

本研究通过对5 个已明确与牦牛重要经济性状显著相关SNP 标记在不同被毛颜色斯布牦牛种群的优势基因型分布进行鉴定， 明确该系列标记中多个位点在两个斯布牦牛种群内存在高比例优势基因型。 首先，作为肌肉调节因子（MRFS）家族重要成员，MyoD1 被广泛证实参与骨骼肌生成调控，研究表明，其能够通过促进非肌细胞转变为肌细胞，调控肌细胞的融合，诱导成肌细胞分化为肌管， 进而融合形成肌纤维 （Rovito 等，2021；Hodge 等，2019； Lee 等，2004）。 Dong 等（2019）和Liu 等（2008）研究发现，MyoD1 基因的遗传变异与家养动物的生长和肉品质经济性状存在显著相关，朱春红等（2016）发现，位于MyoD1 基因内含子1 区的位点突变（T→A）与高邮鸭49 日龄的体重、胸肌重、胸肌横截面积、胸肌纤维直径以及胸肌纤维密度均显著相关（P＜0.05），Wu 等（2012）发现，第2 内含子1 个位点突变（A359T）与鸭8周龄体重显著相关（P＜0.05）。 Du 等（2013）研究发现， 在MyoD1 的外显子1 中的G782A 基因座（MyoD1 BglI）与包括牛西门塔尔及秦川黄等多个品种的腰肌面积显著相关。在兔上，何桦（2013）研究证实，MyoD1 基因外显子4 的同义突变SNP（c.783 GA）与天府黑兔、伊拉兔和香槟兔的全净膛重、半净膛重存在显著相关（P＜0.05）。另外，黄兴等（2019）已研究证实，申扎牦牛MyoD1 基因外显子3 的SNP（MyoD1_C1710T）座位基因型与体尺性状显著（P＜0.05）关联，且杂合的C/T 型为优势基因型。 本研究发现，该位点优势基因型（C/T）在黑色和棕色牦牛群体中较高，分别为56.6667%和46.8750%，暗示MyoD1_C1710T 标记可作为斯布牦牛分子选育的重要标记。

Ryu 等（2019）发现，跨膜蛋白家族是维持细胞各项生理与生物过程的重要组成成分。 Jurvansuu 等 （2008） 研究表明， 跨膜蛋白18（TEME18）可影响癌细胞的代谢和调节并参与神经元干细胞的迁移。Marx 等（2020）和Landgraf 等（2020） 发现，TEME18 基因可通过神经调节参与脂肪细胞分化， 从而影响机体肥胖程度。 Rask-Andersen 等 （2012）、Larder 等（2017）、Zlatohlavek等（2018）关于人与小鼠的研究证实，TMEM18 基因的表达水平及其遗传变异与动物食欲及生长发育紧密相关。 畜牧领域上，Crispim（2015）、林平（2013）、马伟（2017）有关研究报道称，TMEM18 基因上多个SNP 变异与猪和牛的多项体格生长经济性状存在显著相关。当前，张欢等（2017）研究发现，2 个位于TMEM18 基因区域的SNP 标记与牦牛体重、 屠宰率及多项体尺表型显著相关， 包括TMEM18_C4447T 和TMEM18_ C1267T 座位。 尤其研究发现TMEM18_C4447T 位点的C（G）/T（A）和C（G）/C（G）基因型个体均比T（A）/T（A）型个体在胸围、管围及体斜长指标上更具优势。本研究发现两种被毛颜色斯布牦牛群体内该座位的优势基因型比例均达98%以上。

Ma 等（2021）和Stierwalt 等（2021）已证实，长链酰基辅酶A 合成酶1（ACSL1）广泛参与甘油三酯、 磷脂、 胆固醇酯的合成及脂肪酸氧化作用。Chen 等（2019）和Huh 等（2020）研究表明，肝脏细胞及脂肪细胞中过表达ACSL1 可增加长链脂肪酸转化为甘油三酯。 研究发现，ACSL1 表达水平及该基因的大量DNA 遗传变异与奶牛及水牛泌乳量等经济性状显著相关 （Lin 等，2022；Lee 等，2017；Lian 等，2016）。 牦牛上，李钰璨等（2013）研究发现，麦洼牦牛的泌乳期产乳量与ACSL1 等脂肪合成关键酶基因表达水平有关。另外，赵志东等（2019）发现，ACSL1 基因启动子区存在2 个SNP位点（ACSL1_A2079T 和ACSL1_G2409A）被证实与甘南牦牛的乳蛋白率及总固体物质含量、 乳脂率等指标显著相关（P＜0.05），且ACSL1-A2079T的T/A 基因型为乳白蛋白率优势基因型，ACSL1_G2409A 位点的A/A 型为乳脂率和总固体含量指标优势基因型。事实上，随着牦牛产业快速发展，其相关乳制品的市场需求也日益旺盛（张蓝月等，2022；王博等，2021）。 明确优异牦牛类群泌乳性状重要候选标记的优势基因型频率将有助于加速牦牛乳相关性状的选育进程， 提高牦牛产业的肉乳并行健康发展。 最后，本研究结果显示全部5个遗传标记位点在两种被毛颜色斯布牦牛种群中均未显著偏离哈代温伯格平衡（P＜0.05），表明斯布牦牛群体在历史上应该没有经历关于生长及泌乳性能的强烈人工选择。