乌鳢水泡病毒(SHVV)巢式PCR 检测方法的建立与应用

2024-03-11娄剑锋公翠萍肖自东刘晓丹胡大雁劳顺健

科学养鱼 2024年1期

娄剑锋，公翠萍，肖自东，刘晓丹，胡大雁，劳顺健

(1.湖州市南浔区农业技术推广服务中心，浙江南浔 313009；2.湖州市农业科学研究院，浙江湖州313000；3.湖州市农业种质资源创新与应用重点实验室，浙江湖州 313000；4.扬州大学，动物科学与技术学院，江苏扬州 225000）

巢式PCR 是建立在普通PCR 方法基础之上的一种改进型方案，广泛用于病毒基因的检测。但是，目前还没有建立巢式PCR检测乌鳢水泡病毒的报道。本研究通过获取感染乌鳢水泡病毒的杂交鳢组织，获得病毒的相关基因，利用巢式PCR相关技术，通过体系的建立和反应程序的优化，建立一种检测乌鳢水泡病毒的方法，为及时发现并快速诊断乌鳢水泡病毒提供一项重要的技术手段。

一、材料与方法

1.实验样品乌鳢水泡病毒由实验室保存，患病鱼样本采自广东省顺德市杂交鳢养殖场。

2.实验试剂及仪器实验试剂：TRIpure Reagent、异丙醇、氯仿、75%乙醇；DEPC 水、50×TAE 缓冲液、10×EX Taq Buffer (Mg2+plus)、反转录酶、DL2000 DNA Marker、DNA 凝胶回收试剂盒、琼脂糖凝胶(Biowest Agarose)。

实验仪器：PCR 扩增仪、移液器、高速离心机、无菌操作台、电泳仪、凝胶成像分析系统。

3.引物的设计本实验引物的设计根据NCBI已发表乌鳢水泡病毒相关的基因序列，使用Clone Manager 软件, 根据基因组的序列进行比对，寻找到乌鳢水泡病毒(SHVV)核衣壳蛋白基因的保守区域。通过Primerprimer 软件，设计并合成内外两对乌鳢水泡病毒的PCR 引物(SHVV-1F、SHVV-1R；SHVV-2F、SHVV-2R)，引物详情见表1。引物通过南京擎科生物公司制作，经PAGE纯化后,通过ddH2O 配成浓度20 微摩尔/升，-20℃保存备用。

表1 SHVV巢式PCR引物

4.RNA 提取和反转录 RNA 的提取，取实验室保存的乌鳢水泡病毒阳性病料的肝、肾组织。在无菌操作台中，根据RNA 提取说明操作(Trizol法)，提取待检测样品病毒总RNA。提取的RNA很容易降解，需要立即进行反转录或者-20℃保存。

RNA 反转录，取0.2 毫升无酶离心管，配置以下混合液(10 微升)：RNA 模板×5 微升、Oligo Dt Primer(50 微摩尔)×1 微升、dNTP Mixture(10Mm each)×1微升、ddH2O×3微升，在PCR仪中65℃恒温保持5 分钟,迅速插入冰中冷却；通过以上操作步骤，使RNA变性，提高反转录反转效率。反转录体系：变性后的反应物× 10 微升、 5 ×PrimeScript Ⅱ Buffer × 4 微升、 RNase Inhibitor (40 单位/微升) × 0.5 微升、PrimeScript Ⅱ RTase (200 单位/微升) ×1 微升、RNase Free dH2O×4.5 微升，轻轻吹打摇匀。反转录反应：45℃，50 分钟合成cDNA、95℃5 分钟使酶失去活性,随后立即放入冰盒冷却3 分钟，即为cDNA模板，-20℃保存备用。

5.巢式PCR方法的建立巢式PCR需要两对引物通过两轮反应完成，配置的反应体系为20微升。

第一轮反应体系：上述反转录的cDNA 模板×1微升、SHVV-1F×1微升、SHVV-1R×1微升、10×EX Taq Buffer (Mg2+plus)×10 微升、ddH20×7 微升。PCR 反应程序：95℃预变性5 分钟；95℃变性0.5 分钟, 56℃退火0.5 分钟，72℃延伸1 分钟, 30 个循环；然后72℃延伸5 分钟, 最后12℃降温，4℃保存。

随即进行第2 次PCR 扩增，以第1 次的PCR 扩增产物为模板，模板要相应减少，用第2对引物配置PCR 体系。第2 轮体系：PCR 扩增产物×1 微升、SHVV-2F×1 微升、SHVV-2R×1 微升、10×EX Taq Buffer (Mg2+plus)×10 微升、ddH20×7 微升。PCR 反应程序：95℃预变性5 分钟；95℃变性0.5 分钟，56℃退火0.5 分钟, 72℃延伸1 分钟，循环30 次接着72℃延伸5 分钟，最后12℃降温，4℃保存备用。

琼脂糖凝胶电泳检测，配置1×TAE 缓冲液和1.0%琼脂糖凝胶；取5微升扩增样品置于1.0%琼脂糖凝胶孔内，同时DL2000 DNA Marker×6 微升作为参照，使用凝胶电泳仪120 伏电泳30 分钟。电泳完成后，把琼脂糖凝胶放在成像分析系统中观察结果，拍照留存图像。为保证PCR 反应的准确性、特异性，需要做凝胶回收并做相关测序检测。使用琼脂凝胶DNA 回收试剂盒回收DNA，操作步骤参见其使用说明书。凝胶回收完成后，将其回收产物送往南京擎科生物科技有限公司测定序列。

6.特异性检测本实验以鲤春病毒血症病毒、真鲷虹彩病毒、传染性脾肾坏死病毒的DNA或cDNA为检测样品，同时以ddH2O作为阴性对照，用外引物SHVV -1F、SHVV-1R 进行PCR 扩增；以得到的扩增产物为模板，再用内引物SHVV-2F、SHVV-2R 进行二次扩增。配置1.0%琼脂糖凝胶，电泳30分钟,成像。观察相对应条带，分析其特异性。

7.灵敏性检测利用本研究建立的检测方法，对1×104TCID50/毫升的病毒液进行10 倍倍比稀释(100，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8)，随后提取RNA，反转录合成cDNA。以cDNA为PCR模板，以相应体系和程序(同上)，分别进行巢式PCR 扩增。同时需设置一组阴性对照组，以ddH2O 为模板对照。分别取不同浓度PCR 模板的扩增产物5 微升进行1.0%琼脂糖凝胶电泳，同时DL2000 DNA Marker×6微升作为参照，120伏电泳30 分钟，观察成像结果，保存图片，评估本实验建立的方法灵敏性。

8.临床样品检测选择16 个患病杂交鳢肝组织临床样品，提取RNA，之后反转录cDNA。以此为DNA模板，用水作为阴性对照模板，利用上述实验建立的乌鳢水泡病毒巢式PCR检测方法，对所采集的临床样品进行检测，做好结果记录。将阳性结果进行凝胶回收，回收产物送南京擎科生物科技有限公司测定序列，并分析结果。

二、结果与分析

1.巢式PCR结果分析组织样品经过RNA提取步骤获得相关RNA，之后反转录得到cDNA 模板,第一轮以外引物SHVV-1F、SHVV-1R 扩增，成像结果显示(图1)，条带较暗淡，特异性不明显，扩增产物长度在843 bp。以此PCR产物为模板，用第二对内引物SHVV-2F、SHVV-2R 再次进行PCR 扩增，结果显示，扩增单一条带明亮，特异性强，扩增产物长度在397 bp。本次实验病毒样品通过巢式PCR扩增，成像结果显示，单一目的条带明亮，特异性强，实验方法适合于SHVV的特异性检测。

图1 SHVV巢式PCR检测

2.PCR 产物测序结果分析将巢式PCR 扩增产物胶回收后，送往相关公司测序，得到的结果与NCBI 已发表乌鳢水泡病毒(SHVV)相关的基因序列数据进行比对。结果显示，样品基因序列与乌鳢水泡病毒基因序列相对应的片段相一致，从而确定了该检测方法的准确性。

3.特异性检测结果分析通过以上实验建立的乌鳢水泡病毒巢式PCR检测对不同种病毒样品进行检测，结果显示SHVV 呈阳性(图2)，扩增出了397 bp 单一目的条带，实验对照样品鲤春病毒血症病毒(SVCV)、真鲷虹彩病毒(RSIV)、传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)以及ddH2O，均无任何条带，呈阴性。以上实验表明，乌鳢水泡病毒巢式PCR检测方法特异性强，准确性高。

图2 SHVV巢式PCR特异性检测

4.灵敏性检测结果分析根据凝胶成像的结果显示(图3)，当检测样品病毒液稀释浓度为1×10-6倍以内，可观察到明亮的单一条带。当样品病毒液稀释浓度达到1×10-7倍以上，则无法扩增出特异性条带。表明本实验建立的巢式PCR方法对乌鳢水泡病毒最低检测浓度为1×0.01TCID50/毫升。

图3 SHVV巢式PCR灵敏性检测

5.临床样品检测结果分析 16 个临床样品通过SHVV巢式PCR检测，其结果显示(图4)，13个样品扩增出了特异性条带，呈阳性；3个临床样品以及阴性对照ddH2O 无条带，呈阴性。将检测出来的阳性临床样品进行凝胶回收，回收产物进行基因测序。检测出的基因序列同乌鳢水泡病毒(SHVV)相关的基因序列比对。结果显示，呈阳性的检测样品基因序列与SHVV 基因序列一致，表明本实验建立的SHVV 巢式PCR 方法特异性强、灵敏度高，能够准确、快速地检测出患病鱼是否感染乌鳢水泡病毒，可运用于临床样品的检测。