桑黄改善非酒精性脂肪肝的分子机制研究

刘静雨 曲 凡 单秋丽 何文兴 陈安徽

（1徐州工程学院食品与生物工程学院，江苏徐州 221028；2济南大学生物科学与技术学院，山东济南 250022）

桑黄（Sanghuang）是一种寄生于桑树树干处常年生真菌，名为桑黄属桑黄，是桑黄属成员。相关文献表明桑黄主要活性成分能够治疗糖尿病和肺炎，以及在减轻感染性休克、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、降低血脂、预防和治疗自身免疫关节炎症等方面起着重要作用，其中三萜、多糖和黄酮类化合物是3种主要的药理活性化合物[1]。桑黄活性成分提取方法有醇提法和水提法，不同提取法所获得的活性成分种类及功能不同[2-3]。TAJI等[4]在1968年证实桑黄子实体水提物具有较强的生物活性，可用于抑制小鼠肉瘤细胞的生长。此外，SHIBATA等[5]证实桑黄子实体醇提物能够抑制肝癌细胞增殖的功能。并且近年来有大量关于桑黄药用功能的研究报道，进一步描述这种真菌的抗肿瘤和抗氧化特性[6-7]。

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一种在没有过度饮酒的情况下，肝脏内脂肪积累过多为主要特征的临床病理综合征[8]。近几十年研究发现遗传、饮食和环境因素的相互作用是NAFLD发病的媒介[9]。NAFLD的发病进程可分为单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪肝炎（non-alcoholic steatosis heptitis，NASH）以及肝硬化，最终严重危害人体生命健康[10]。近年的研究数据显示：目前，NAFLD的全球发病率约为25%[11]，被认为是全球慢性肝病日益增长的重要原因，并已成为近年肝移植的主要原因之一[12]；在中国，NAFLD的患病人数急剧增加到30%[13]。

NAFLD的发病通常伴随着各种代谢疾病的发生，如糖尿病和肥胖症。它被认为是肝脏代谢综合征的一种表现。Sanghuang Kangneng醇提物（ethanol Sanghuang Kangneng，ESK）主要提取Sanghuang Kangneng中多酚类和黄酮类化合物，前人研究显示，部分多酚类和黄酮类化合物可改善NAFLD，但是对于其改善NAFLD的分子机制尚不明确。人正常肝细胞系WRL68细胞是一类永生化肝细胞株，对生长环境的改变有比较高的灵敏度。笔者以WRL68细胞作为体外试验模型，研究ESK改善非酒精性脂肪肝的相关分子作用机制，为今后的研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

FFA，北京索莱宝科技有限公司；胎牛血清（FBS），北京赛默飞世尔科技有限公司；高糖DMEM培养基，北京赛默飞世尔科技有限公司；青霉素，北京索莱宝科技有限公司；链霉素，北京索莱宝科技有限公司；MTT试剂，北京索莱宝科技有限公司；油红O，上海和序生物科技有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒，碧云天生物公司；甘油三酯（TG）测试盒，南京建成生物工程研究所；总胆固醇（TC）测试盒，南京建成生物工程研究所；Triton X-100，北京索莱宝科技有限公司；Trizol，南京诺唯赞生物科技有限公司；反转录试剂盒，南京诺唯赞生物科技有限公司；荧光定量PCR试剂盒，南京诺唯赞生物科技有限公司；无水乙醇，国药集团化学试剂有限公司；槲皮素，北京索莱宝科技有限公司；没食子酸，北京索莱宝科技有限公司；淫羊藿苷，北京索莱宝科技有限公司；芦丁，北京索莱宝科技有限公司；绿原酸，北京索莱宝科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 ESK提取

桑黄产于江苏省，由徐州工程学院陈安徽鉴定并命名为Sanghuang Kangneng。称取Sanghuang Kangneng20 g，置50 ℃烘箱内烘至4 h，研磨过筛（孔径0.85 mm）。加入10倍体积的90%乙醇85 ℃索氏提取2 h。布氏漏斗过滤提取溶液，旋转蒸发仪55 ℃旋转蒸发五分之四溶液，浓缩液低温冷冻干燥成粉末（命名为ESK），所提取的ESK放置-20 ℃长期保存。

1.2.2 高效液相色谱分析

高效液相色谱分析ESK样品溶液的配置：准确称取ESK样品10 mg，将其溶解于1 mL甲醇（色谱级），10 000g离心20 min，配成样品储备液，过0.22 μM无菌滤膜过滤，收集液体部分。高效液相色谱分析标准溶液的配置：取槲皮素、没食子酸、咖啡酸、淫羊藿苷、芦丁、绿原酸标准品各10 mg，将其溶解于1 mL甲醇（色谱级），10 000g离心20 min，配成标准混合样品储备液，用0.22 μM无菌滤膜过滤。

色谱条件：色谱柱选择YMC-Pack ODS-AQ反相C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相由A、B两部分组成，A相：乙腈∶甲醇∶超纯水（体积比）=19∶5∶76（pH 3.0）；B相：乙腈∶甲醇∶超纯水（体积比）=55∶15∶30（pH 3.0）。流速为1 mL/min，柱温为30 ℃，检测波长为256 nm；进样量为10 μL，梯度洗脱条件见表1。

表1 梯度洗脱条件

1.2.3 细胞培养

人正常肝细胞（WRL68）购买于上海传秋生物科技有限公司（上海总部），在高糖DMEM培养基中培养，培养细胞时在培养基中加入10%的胎牛血清、100 mol/mL青霉素和100 mg/mL链霉素，将细胞放置于37 ℃和5% CO2的细胞恒温箱中进行体外培养。

1.2.4 细胞活力测定

使用MTT比色法检测细胞活力。收集并重悬细胞，控制细胞接种密度，将药物暴露24 h、48 h的细胞和药物暴露72 h的不同密度的细胞接种于96孔板中。质量浓度为5%CO2、37 ℃条件下培养过夜，待细胞贴孔底壁后对其进行不同质量浓度的药物暴露，分别按照100 μL/孔的暴露体积进行处理，随后将96孔板继续培养。药物处理结束后，将原加药物的培养基吸出，每孔加入100 μL新培养基和10 μL MTT溶液（5 mg/mL），混匀，37 ℃继续培养4 h。孵育结束后，将孔板内培养基弃去，每孔加150 μL DMSO，孔内形成的结晶物充分溶解后，再用酶标仪在490 nm处测量各孔的吸光值。

1.2.5 油红O染色

收集并重悬细胞，控制细胞接种密度，在24孔板里药物暴露24 h+72 h的细胞接种密度为1.6×105个/孔，质量浓度为5%CO2、37 ℃条件过夜培养，待细胞贴孔底壁进行暴露试验；暴露结束后，将24孔板里原加药物的培养基吸出，用PBS轻洗；每孔加入200 μL质量分数为4%的多聚甲醛，避光固定30 min后，用PBS轻洗；每孔快速滴加200 μL油红O工作液，避光染色20 min；每孔加适量质量分数为60%的异丙醇漂洗1 min，去掉浮色后用灭菌水漂洗至无色。镜下观察并成像。

1.2.6 细胞内总蛋白、TG和TC含量测定

将药物处理的细胞胰酶消化后分别收集于对应标记的EP管中，离心后弃上清；用灭菌PBS洗涤细胞沉淀2～3次，再次离心弃上清；每管中加入1%Triton X-100 30 μL，用旋涡振荡仪将细胞沉淀振荡开，冰上裂解细胞2 h，每隔30 min用旋涡振荡仪对细胞沉淀振荡使其充分裂解。吸取上裂解液，按照试剂盒说明书测定细胞内TG、TC以及总蛋白的含量。

1.2.7 实时荧光定量PCR

使用Trizol法提取各组细胞的mRNA，并按照反转录试剂盒的方法进行反转录。根据表2反应条件进行实时荧光定量PCR，结果根据各组Ct值，使用2-△△Ct法计算目的基因与内参基因β-actin的相对表达量（基因相对表达量计算公式使用2-ΔΔCt：其中ΔCt为目的基因和内参基因Ct值差值）。所有引物信息如表3，以β-actin为内参标准化目的基因。

表2 实时荧光定量PCR反应条件

表3 WRL68 qRT-PCR引物

1.3 统计分析

数据使用GraphPad Prism7软件进行统计学分析和作图。样品重复孔数为3，数据结果表示为平均值±标准误。两个组之间的比较选择t检验，多组间比较选择双因素方差分析，*表示P≤0.05，**表示P≤0.01，***表示P≤0.001。

2 结果与分析

2.1 样品定性分析结果

通过对比标准品HPLC图谱（图1）可以推断出，ESK中含有槲皮素、没食子酸、咖啡酸、淫羊藿苷、芦丁、绿原酸物质。

图1 HPLC定性分析结果

2.2 ESK对WRL68细胞活力和脂质代谢的影响

如图2所示，暴露于ESK24 h后，WRL 68细胞凋亡数目无明显增加，然而与对照相比，暴露于32 μg/mL、160 μg/mL、320 μg/mL的ESK48 h以及72 h细胞凋亡数目增加，160 μg/mL的ESK培养正常细胞72 h，细胞凋亡15%；相同处理时间320 μg/mL药物暴露细胞凋亡为对照的23%，均在药物处理细胞凋亡可接受范围内，因此选3.2 μg/mL、32 μg/mL、160 μg/mL以及320 μg/mL的ESK72 h处理。

图2 ESK不同时间及质量浓度暴露对WRL68细胞活力的影响

如图3a所示，与高脂细胞未进行ESK处理的对照相比，ESK处理72 h后，高脂细胞内TG含量显著降低，并且随着ESK质量浓度的进一步增加，TG含量也逐渐降低。3.2 μg/mL的ESK暴露使得高脂WRL68细胞内TG含量显著减少37%（P＜0.01），并且发现3.2 μg/mL的ESK不影响高脂细胞内TC水平，而用32 μg/mL和160 μg/mL的ESK暴露时，TC含量分别显著降低40%和35%（P＜0.001，图3b）。然而，尽管320 μg/mL的ESK处理会显著降低高脂WRL68细胞内TC含量（降低22%，P＜0.001），但相较于160 μg/mL的ESK处理，高脂细胞内TC水平却略有上升。此外，油红O染色结果显示：相比较于高脂细胞未进行ESK处理的对照，32 μg/mL和160 μg/mL的ESK处理能够显著降低WRL68细胞内脂滴（箭头）的形成（图4）。

图3 ESK对高脂细胞内脂质水平的影响

图4 不同质量浓度ESK对高脂WRL68细胞油红O染色影响

2.3 ESK对WRL68细胞脂质代谢相关基因表达的影响

为了初步阐明ESK减少高脂WRL68细胞内脂质含量的潜在机制，分别从脂质运输、脂质合成和脂质氧化方面来探讨ESK的作用机制。如图5a、5b所示，与高脂细胞未进行ESK处理的相比，320 μg/mL的ESK处理能够显著降低高脂细胞内参与脂质生成的Srebp-1c和Fas的表达，分别降低51%和39%（P＜0.05）。此外，32 μg/mL的ESK处理还能显著下调参与脂质运输的关键基因如CD36（下调29%，P＜0.05）的表达水平（图5c）。而脂质氧化相关基因PPARα表达没有变化（图5d）。

图5 ESK对高脂WRL68细胞脂质代谢相关基因表达的影响

3 小结

目前NAFLD是世界上常见的疾病之一，已成为研究热点，迫切需要治疗NAFLD新的药物。Sanghuang Kangneng是一种寄生于桑树树干处常年生真菌，其主要核心成分已知。以前的研究报道Sanghuang可以防止急性肝毒性和调节肝功能[14]。在目前的研究中，使用的FFA诱导模型，是一个被广泛接受的高脂肝细胞模型。笔者首次确定ESK在减轻高脂肝细胞内脂积累、治疗NAFLD发病机制中的作用。

TC和TG是机体发生高脂相关症状时常需检测的重要指标，当这两种生化指标异常时，初步认定检测的细胞或组织内部脂代谢异常。为了显示细胞内的脂肪含量常采用油红O进行细胞染色，因为油红O是一种脂溶性染料，在脂肪内能够高度溶解，因此其可特异性的使组织内TC等中性脂肪染为红色。ESK显著减少了高脂肝细胞内TC和TG含量，油红O染色图显示ESK显著减少了高脂肝细胞内中性脂肪含量，因此可初步判断ESK减少了高脂肝细胞内脂质积累。

利用WRL68细胞作为体外试验模型，通过设计不同的暴露剂量，考察ESK暴露对WRL68细胞的活力影响。在ESK处理FFA诱导的高脂细胞模型试验中，高脂WRL68细胞随ESK质量浓度增加，细胞内脂质蓄积显著降低。通过qRT-PCR技术发现，ESK暴露可显著影响高脂WRL68细胞内与脂质代谢相关基因的表达，其可能的模式有通过抑制细胞内SREBP-1c和Fas基因表达，抑制脂质合成，以及通过激活PPARα来促进肝细胞内脂肪酸氧化，这些可减缓NAFLD的第一发病阶段。