一株野生硫黄鳞伞的分离纯化及菌丝培养条件优化

2024-03-11高恋恋王新童曾粮斌魏宝阳

食用菌 2024年1期

高恋恋王新童张浩涂镜曾粮斌魏宝阳*

（1湖南农业大学生物科学技术学院，湖南长沙 410128；2 沅江市芦小妹食品有限公司，湖南沅江 413100；3中国农业科学院麻类研究所，湖南长沙 410205）

硫黄鳞伞（Pholiota conissans）隶属于担子菌门（Basidiomycota）、蘑菇纲Agaricomycetes、蘑菇目（Agaricales）、球盖菇科（Strophariaceae）、鳞伞属（Pholiota），是一种食药兼用的小型真菌。鳞伞属分布广泛，全球约150种[1]，国内已知的鳞伞属真菌有68种[2-4]，如多脂鳞伞（P.adiposa）[5]、白鳞伞（P.destruens）[6]、翘鳞伞（P.squarrosa）[7]和柠檬鳞伞（P.limonella）[8]等，广泛分布我国27个省区[9]，其中多数物种为木腐型真菌。鳞伞属真菌中富含多种营养物质和活性物质[10-11]，具有抗癌、抗肿瘤和抗氧化等作用[12-13]，因此，硫黄鳞伞是深受人们喜爱和青睐的“一条腿”保健食物。

笔者对采自湖南省沅江市天下第一芦苇荡的一株野生菌株进行分离、纯化及鉴定，最终确定其分类学地位；同时通过单因素试验探究其菌丝在固体培养基中的生长情况，以此了解硫黄鳞伞菌丝固体培养基培养条件。羊晨等[14]研究发现，附加基质可促进肺形侧耳菌丝体的生长并增强菌株抗木霉污染能力，因此，笔者在液体发酵培养基中分别添加5种附加基质粉末，探究附加基质对硫黄鳞伞液体菌丝生物量的影响，以期为硫黄鳞伞开发利用、液体发酵和活性物质的提取等提供理论指导和数据支撑。

1 材料与方法

1.1 供试材料

（1）供试菌株：野生菌株采自沅江市天下第一芦苇荡，由湖南农业大学生物科学技术学院实验室进行分离、纯化，该菌株由中国农业科学院麻类研究所保藏，编号为Y1。

（2）供试附加碳源基质：选用干燥无霉变的芦苇、稻草、木屑、玉米芯、麸皮等原料，粉碎，并过40目筛（孔径0.45 mm），取粉末干燥备用。

（3）供试培养基：①PDA培养基为马铃薯20%、葡萄糖2%、琼脂1.5%，pH自然，蒸馏水1 000 mL。②碳源培养基为碳源20 g、酵母粉2 g、蛋白胨2 g、磷酸二氢钾3 g、硫酸镁1.5 g、琼脂18 g，pH自然，水1 000 mL[15]。③氮源培养基为碳源20 g、氮源2 g、磷酸二氢钾3 g、硫酸镁1.5 g、琼脂18 g，水1 000 mL，pH自然。④基础发酵液体培养基为葡萄糖3%、酵母粉0.3%、磷酸二氢钾0.4%、硫酸镁0.2%、维生素B10.02%，加水定容至1 000 mL，pH自然。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株的分离与纯化

用自来水冲洗幼嫩供试菌株子实体表面以及菌柄处的泥土，将其放入体积分数75%乙醇中浸泡5 min后取出，用无菌解剖刀自菌柄处切开少许，然后掰开子实体。在菌盖、菌盖与菌柄交界处切取米粒大小的菌肉，置于涂布100 μL质量浓度为50 mg/mL硫酸链霉素的PDA平板上，用封口膜封口后，于25 ℃生化恒温培养箱中暗培养，待菌丝块长至直径2～3 cm转接、纯化，获得纯种菌丝，置4 ℃冰箱保藏备用。

1.2.2 菌株形态学鉴定

观察野生菌株生长环境，子实体形态、大小、颜色，孢子形态，孢子印颜色，菌丝颜色以及菌柄着生方式等特征并拍照，结合《中国大型菌物资源图鉴》（李玉2015）进行形态学初步鉴定。

1.2.3 菌株分子鉴定

采用内源转录间隔（Internal Transcribed Spacer，ITS）鉴定法。菌丝体总DNA提取采用真菌DNA提取试剂盒。PCR扩增采用真菌ITS通用引物ITS1和ITS4[16]，PCR反应体系为25 μL，每份体系包含12.5 μL 2×Es Taq MasterMix，ITS1和ITS4（100 μmol/L）各1 μL，1 μL DNA模板，9.5 μL ddH2O。PCR产物以1.5%琼脂糖凝胶电泳检测并测序，将获得的ITS序列输入NCBI中进行BLAST比对，选取与菌株Y1近缘关系不同的菌株ITS序列，利用MEGA 11软件构建系统发育树，进行同源性分析。

1.2.4 菌株活化

将贮存在4 ℃的硫黄鳞伞菌株取出，在超净工作台上将其接种于PDA培养基上，置25 ℃恒温箱中暗培养，备用。

1.2.5 固体培养基培养条件的优化

1.2.5.1 光照试验

挑取活化后的硫黄鳞伞直径为4 mm菌丝块接于PDA中，置光照气候箱中25 ℃培养7 d。通过调整包裹平板的遮光纸，设5个光照强度，分别为0 lx、500 lx、1 000 lx、1 500 lx、2 000 lx。每个处理5个重复。

1.2.5.2 温度试验

挑取4 mm活化后的硫黄鳞伞菌丝块接于PDA中，然后分别置19 ℃、22 ℃、25 ℃、28 ℃、31 ℃恒温培养箱中培养7 d。每个处理5个重复。

1.2.5.3 碳源试验

采用碳源培养基，分别添加碳源为葡萄糖、甘油、蔗糖、可溶性淀粉、乳糖，接种同1.2.5.2。然后置25 ℃恒温暗培养7 d。

1.2.5.4 氮源试验

采用氮源培养基，分别添加氮源为酵母粉、尿素、蛋白胨、硫酸铵、牛肉膏，接种、培养同1.2.5.3。

1.2.5.5 无机盐试验

采用最优碳源和氮源培养基，分别添加磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钠、硫酸钾，接种、培养同1.2.5.3。

1.2.5.6 pH试验

采用最优碳源、氮源、无机盐培养基，将其pH调至5、6、7、8、9，接种、培养同1.2.5.3。

1.2.6 附加基质对供试菌株液体菌丝生长影响

采用液体发酵培养基，分别添加0.3%的稻草、芦苇、木屑、玉米芯、麸皮5种附加基质，接种后，于25 ℃，180 r/min摇床培养7 d。以不添加附加基质处理为对照。

1.3 测定项目及方法

（1）菌落直径测定。观察并记录固体培养基中菌丝生长情况，采用十字交叉法测量菌落直径。

（2）菌丝生物量的测定。液体发酵结束后，将发酵液用无菌纱布过滤，所得沉淀物为硫黄鳞伞菌丝体与培养基混合物，将其烘干至恒重，即为培养基混合物与菌丝体干质量。称取等量的附加基质于配置好的液体培养基中，直接离心取沉淀烘干，即为培养基混合物干质量。两者之差即为发酵菌丝体生物量[mg/（100 mL）]。

1.4 数据分析

采用Excel 2021软件、Word 2021软件进行数据处理，PowerPoint 2021进行图片处理，IBM SPSS Statistics 26软件进行数据处理、差异显著性分析和方差分析。

2 结果与分析

2.1 菌株生态环境调查及形态学鉴定

供试野生菌株采自于湖南省沅江市天下第一芦苇荡（图1），子实体长于芦苇地中，属于腐生木腐菌，丛生，无菌环无菌托，体积较小，菌盖直径1～3 cm，呈伞形，菌盖浅黄褐至锈黄色，中间略凸起，表面较光滑有黏液。该菌菌柄中央生，中空圆柱状，略弯，长2～5 cm，直径为1.5～3.5 mm，菌柄的颜色为黄白色，比菌盖颜色略淡。该菌孢子印为褐色。初步认定该菌株隶属于担子菌门、蘑菇纲、蘑菇目、球盖菇科、鳞伞属，是一种可食用的大型真菌。该菌株经PDA纯化培养，菌丝长势洁白且浓密，菌落边缘整齐，质地松软、无色素产生（图1c）。菌株Y1的显微特征与吴芳等[17]探究的鳞伞特征一致。菌株Y1菌丝体为无色，有隔且隔间距不等，有锁状联合，可分叉出新的菌丝，孢子呈无色，椭圆形，表面无棱角，无凸起（图2）。

图1 菌株Y1的子实体及平板菌丝菌落

图2 显微镜下菌株Y1菌丝及孢子

2.2 野生菌株分子鉴定结果

基于ITS的系统发育树分析，经北京擎科生物科技有限公司测序，菌株Y1的序列为

CATTTGGGATGACTTGGTATGATTGTTGCTGGTCCTTTT GGGACATGTGCACATCTGCCATCTTTATATCTCCACCTGTGCA CACTTTGTAGGTCTGGAATAAGTATCTGGGGTAACTCAGTTGT TGGAATTGCTGCTGCAAAGTAGCTTTTCTTGTGATTCTAGATC TATGTTTTCATATACACCATAAAAATGTAACAGAATGTATTAA TGGGTGTTGTACCTATAAACTATATACAACTTTCAGCAACGGA TCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGAT AAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTG AACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCGAGGAGCATGCCTGTT TGAGTGTCATTAAATTCTCAATCTTACCATCTTTTATTAGTTG GGAAAGAGTTGGATGTGGGGGGAAATTTTTGAAGGTTTTTCGA AGCCTTCTCCCCTGAAATGCATTAGCTGGATGCTCGCGCGGAC AGTCTATTGGTGTGATAATTATCTATGCCATTAGCTGACTGCC ATTAGTAGCTCTGCTTCTAACTGTCTTTGGACAATTTATGACA ATTTGACCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCA TATCAATAAAGCCGGAGGAACTTTT

经BLAST在线对比，该序列与Pholiota conissans的相似性为99.38%。使用MEGA 11软件将所下载序列与菌株Y1序列进行对比分析并构建系统发育树，结果如图3。该野生菌株Y1的ITS序列与硫黄鳞伞聚为一支，可以确定其为硫黄鳞伞。

图3 基于ITS序列的菌株Y1系统发育树

2.3 固体培养基培养条件优化

2.3.1 光照强度对硫黄鳞伞Y1菌丝生长的影响

由表1可知，光照强度在0～2 000 lx硫黄鳞伞Y1菌丝均能生长，菌丝较为洁白，但不同光照强度菌落直径有所差异。无光照下菌落直径及菌丝长势明显优于其他处理，说明该硫黄鳞伞Y1在菌丝生长阶段不需要光照，过强的光照对菌丝的生长具有抑制作用（图4）。

表1 光照强度对硫黄鳞伞Y1菌丝生长的影响

图4 不同光照强度下硫黄鳞伞Y1菌株菌落形态

2.3.2 培养温度对硫黄鳞伞Y1菌丝生长的影响

由表2可知，供试硫黄鳞伞菌株在19～31 ℃均可生长，19～28 ℃菌丝生长逐渐加快，31 ℃菌丝生长缓慢，25 ℃、28 ℃菌落直径明显大于其他处理，其中28 ℃菌落直径最大，但25 ℃的菌丝长势较28 ℃更为浓密且粗壮（图5）。

表2 温度对硫黄鳞伞Y1菌丝生长的影响

表3 不同碳源对硫黄鳞伞Y1菌丝生长的影响

图5 不同温度下硫黄鳞伞Y1菌株菌落形态

2.3.3 不同碳源对硫黄鳞伞Y1菌丝生长的影响

由表4可知，供试硫黄鳞伞菌株在5种供试碳源培养基上均可生长，碳源为蔗糖培养基的菌落平均直径最大，显著大于甘油、葡萄糖、乳糖、可溶性淀粉培养基（图6），因此确定蔗糖为最适碳源。

表4 不同氮源对硫黄鳞伞Y1菌丝生长的影响

图6 不同碳源培养基上硫黄鳞伞Y1菌落形态

2.3.4 不同氮源对硫黄鳞伞Y1菌丝生长的影响

由表4可知，供试硫黄鳞伞菌株在除尿素以外的4种供试氮源培养基上均可生长。含蛋白胨培养基中菌落直径和菌丝长势明显优于其他氮源培养基（图7），因此蛋白胨为硫黄鳞伞Y1最适氮源。

图7 不同氮源培养基上硫黄鳞伞Y1菌落形态

2.3.5 不同无机盐对硫黄鳞伞Y1菌丝生长的影响

由表5可知，供试硫黄鳞伞菌株在供试无机盐培养基上均可生长，氯化钠和硫酸钾培养基中硫黄鳞伞Y1的菌落直径明显小于硫酸镁培养基。磷酸二氢钾、硫酸镁培养基中硫黄鳞伞Y1的菌落直径无显著差异，但菌丝长势不同（图8）。

表5 不同无机盐对硫黄鳞伞Y1菌丝生长的影响

2.3.6 pH对硫黄鳞伞Y1菌丝生长的影响

由表6可知，硫黄鳞伞Y1在pH为9时，菌丝不萌发；在pH为5～8的培养基上均能生长，其中pH为5、6时菌落直径和菌丝长势明显优于其他处理（图9），因此pH 5～6为最适pH。

表6 不同pH下硫黄鳞伞Y1菌丝生长情况

图9 不同pH下硫黄鳞伞Y1菌落形态

2.4 不同附加基质对硫黄鳞伞Y1液体菌丝生物量的影响

由图10可知，CK与5种附加基质的发酵液均为黄色且澄清，菌丝均可形成新菌丝球，菌丝球形状不规则且呈黄色绒毛状，界限分明，各处理菌丝球大小差异显著（P＜0.05）。其中麸皮、玉米和芦苇发酵液中菌丝球大小均一，稻草与木屑发酵液菌丝球不均一。与CK相比，麸皮、芦苇和玉米芯发酵液均能提升菌丝生物量，麸皮发酵液菌丝球密度相对较大，效果最优，菌丝生物量最大，为494 mg（/100 mL）（图11），而稻草和木屑对硫黄鳞伞Y1菌丝生长有抑制作用。各附加基质对硫黄鳞伞Y1菌丝生物量的影响为麸皮＞芦苇＞玉米芯＞CK＞稻草＞木屑。