梵净山野生灰树花种质资源筛选
2024-03-11何荣健雷佳玉顾昌华
何荣健 雷佳玉 杨 慧 岑 香 杨 昆 顾昌华*
（1铜仁职业技术学院食用菌工程中心，贵州铜仁 554300；2安顺学院，贵州安顺 651000）
灰树花（Grifola frondosa）又名莲花菌、舞茸等，是灰树花科（Grifolaceae）、灰树花属（Grifola）的珍稀食药用菌[1]，常生长在板栗树、栎树等壳斗科植物树桩周围[2]。灰树花营养丰富，口感脆嫩，具有独特清香，富含多糖、糖蛋白、氨基酸、维生素等营养与生物活性物质[3-4]，具有较好的免疫调节、肿瘤抑制、抗病毒等保健功能[5-8]。灰树花因具有独特口感与保健功效，其市场发展前景广阔。近年来，我国围绕灰树花药用价值、菌种选育、培养基配方和栽培管理等方面开展大量研究[9-10]，但研究所用灰树花菌株多数引自日本，对本土野生灰树花资源开发利用较少。
梵净山国家级自然保护区地处亚热带，属山地季风气候，独特的地理环境和气候条件，造就了丰富的野生食药用菌资源[11-12]。为此，笔者以梵净山野生灰树花为材料，通过组织分离获得灰树花菌株，并研究其农艺性状及遗传关系，初步筛选评价野生灰树花种质资源，以期筛选适合铜仁市气候的优良灰树花菌株，为开发利用梵净山野生灰树花提供参考。
1 材料与方法
1.1 供试材料
供试菌株见表1，7株菌株均采自贵州省梵净山，为野生菌株。供试培养基为PDA培养基。
表1 供试灰树花菌株
1.2 试验方法
1.2.1 野生灰树花菌株分离纯化
将野生灰树花子实体擦拭干净，在无菌环境下用无菌解剖刀将子实体切开，取菌柄菌盖交界处未污染的组织块，迅速放至平板培养基上，于25 ℃恒温暗培养。待平板上形成菌落，挑取菌落边缘菌丝，转接至空白平板培养基上纯化培养，并将纯化后的菌株置于4 ℃冰箱保藏备用。
1.2.2 野生灰树花鉴定
测量和观察梵净山野生灰树花的子实体大小、形状、颜色等特征。利用DNA提取试剂盒（TSINGKE）提取野生灰树花菌株DNA，通过引物ITS1/ITS4扩增野生灰树花ITS序列，扩增产物检测后测序，并利用NCBI进行BLAST比对，利用MAGE 7进行遗传距离计算和构建系统发育树。
1.2.3 野生灰树花菌株拮抗试验
选用PDA平板培养基，将供试菌株两两组合，分别接种至平板两侧，置25 ℃培养箱内倒置培养，观察不同菌株菌丝接触区有无拮抗反应。每个组合3个重复。
1.2.4 菌株培养特性
用打孔器取直径9 mm菌块接种到PDA培养基平板中央，置25 ℃恒温暗培养。观察菌丝生长情况，并采用十字交叉法测量菌落直径，计算试验菌株菌丝平均生长速度，观察比较供试菌株菌丝长势。每个菌株设3个重复。
2 结果与分析
2.1 供试菌株鉴定
2.1.1 供试野生灰树花菌株子实体形态初步比较
梵净山野生灰树花种质资源丰富，供试菌株灰树花子实体形态、颜色、大小，菌片长宽等形态特征存在显著性差异（表2，图1）。灰树花HSH-3菌株的子实体呈鹿角状，菌盖分化不完全，为畸形菇；HSH-7菌株的子实体呈灰白色，大小（33.2 cm×35.6 cm）和菌褶宽度均最大；HSH-4菌株和HSH-5菌株朵形最好，为莲花状，菌片形态最佳。综合分析表明，HSH-7、HSH-4、HSH-5菌株可作为良好育种材料。
图1 野生灰树花子实体形态
表2 野生灰树花子实体形态特征
2.1.2 系统发育分析
基于rDNA-ITS序列，对供试野生灰树花序列进行BLAST比对和系统发育分析，结果表明：所有供试菌株与灰树花（Grifola frondosa）同源性均在99%以上，7株野生灰树花菌株遗传距离较小，其中，HSH-1菌株与HSH-7菌株的亲缘关系较近，HSH-2菌株、HSH-3菌株、HSH-4菌株、HSH-5菌株、HSH-6菌株的亲缘关系较近（图2）。
图2 供试野生灰树花菌株遗传距离
2.2 供试野生灰树花菌株拮抗试验结果
由表3、图3可知，7株供试野生灰树花菌株间两两组合均发生拮抗反应，但拮抗反应程度有所不同。HSH-6菌株、HSH-7菌株与其他菌株均存在非常明显的拮抗反应，表明HSH-6、HSH-7菌株与其他菌株存在较大遗传差异。
图3 部分供试灰树花菌株拮抗反应状态
表3 供试野生灰树花菌株拮抗反应情况
2.3 供试野生灰树花菌株菌丝培养特性
由表4可知，7株野生灰树花菌株菌丝生长速度差异显著，其中，HSH-1菌株菌丝生长速度最快，达4.61 mm/d；其次是HSH-7菌株，生长速度为4.44 mm/d，显著高于其他野生灰树花菌株；HSH-5、HSH-4菌株生长速度次之，分别为4.28 mm/d和4.11 mm/d；HSH-6菌株生长速度最慢。所有供试灰树花菌株菌落颜色由洁白至乳白色（图4）。综合分析表明，HSH-1菌株菌丝生长特性最佳。
图4 供试野生灰树花菌株平板培养菌落形态
表4 供试野生灰树花菌株菌丝生长特性
3 小结
梵净山野生灰树花种质资源丰富，7株供试灰树花菌株均采自梵净山，菌株间遗传距离较小，供试灰树花子实体形态特征差异显著，除HSH-3菌株子实体呈鹿角状，明显畸形外，其他供试菌株均可作为优良育种材料。系统发育分析表明，7株供试灰树花菌株分为两个类群（支系），HSH-1菌株、HSH-7菌株的亲缘关系较近，HSH-2至HSH-6菌株的亲缘关系较近；供试灰树花菌株间均存在一定拮抗反应，HSH-6菌株、HSH-7菌株与其他菌株均存在非常明显的拮抗反应；供试灰树花菌株菌丝培养特性差异显著，除HSH-6菌株、HSH-3菌株外，其他菌株菌丝生长普遍较快。灰树花HSH-1菌株菌丝生长速度最快，HSH-7菌株菌丝生长速度次之。综合比较分析，HSH-1、HSH-2、HSH-4、HSH-5、HSH-7菌株的生物学特性较好，可作为优良种质资源进行开发利用。
