几种植物醇提物对血耳木霉病原菌抑菌试验

程 旭 隋 哲 田朋姣 刘兴乐 杨 青 王文建 张 舒 王佐乾* 余海忠*

（1 襄阳市农业科学院，湖北襄阳 441053；2 湖北文理学院，湖北襄阳 441053；3 湖北省农业科学院，湖北武汉 430064）

食用菌产业已成为继粮、油、果、菜后的第五大产业，是我国重要的农业产业之一，已成为乡村振兴尤其是偏远山区农民增收致富的重要途径[1]。2021年全国食用菌总量达4 133.94万t，总产值达3 475.63亿元，中国食用菌占全球食用菌总产量的85%以上[2]。血耳（Tremella sanguinea）隶属银耳属（Tremella），是一种珍稀食用菌，具有较高的营养和药用价值，深受消费者欢迎。目前血耳人工段木栽培的技术刚实现突破，产地主要集中在湖北省保康县，2021年栽培总量约5万棒段木，年产值约500万元，并呈现逐年递增的态势，“保康血耳”也获中国地理标志产品保护。

但是，目前血耳生产中出现的木霉病害，已成为制约其规模化生产的主要因素之一。木霉病害是一种典型的竞争性病害，会造成母种、原种、栽培种、段木菌棒、栽培袋的污染，常见的木霉病害至少有6种[3-4]。木霉（Trichodermasp.）可侵染平菇、茶树菇、香菇、银耳、杏鲍菇、毛木耳、灵芝等多种食用菌的培养料、菌丝和子实体，是食用菌生产中的第一大污染菌[5]。不同产地食用菌感染的木霉种类各有不同，其中绿色木霉与哈茨木霉是优势菌种。木霉侵染主要表现为产生绿色、青绿色或者黄绿色霉层，它不仅污染菌种和培养料，造成菌种或菌袋报废，同时还可寄生在食用菌菌丝和子实体上引起寄生性病害[6]。据报道，由木霉造成的食用菌病害每年平均发病率为8%，食用菌损失率40%～50%，有时高达80%，甚至导致绝收[7]。

试验以血耳生产中最常见的绿色木霉（Trichoderma viride）为靶标病原物，以鄂西北地区常见的四种植物60%乙醇提取物为供试药液，考察其对为害血耳的木霉病害抑制效果，以期开发出绿色无公害的木霉病害专用植物源杀菌剂。

1 材料与方法

1.1 试验材料

（1）供试植物：襄麦冬（L.spicatavar.prolifera）须根采自襄阳市欧庙镇，鱼腥草（H.cordata）、猫眼草（E.lunulata）、五香菜（H.moslae）全草，采自襄阳市卧龙镇。按以下步骤对上述样品进行处理：自来水冲洗，蒸馏水润洗，晾干，65 ℃烘干后，150目粉碎，密封，置于4 ℃保存待用。

（2）供试菌株：绿色木霉（T.viride）菌株，从血耳段木上分离提纯。

（3）耗材与设备：60%乙醇，葡萄糖，琼脂粉，生理盐水；FZ-102微型植物粉碎机；GZX-9030-MBE电热恒温干燥箱；YSQ-LS-30SII压力蒸汽灭菌器；RE-52 AA旋转蒸发仪；AL204电子天平；热电微量移液器；KQ-100B型超声波清洗器；HZ-9211K振荡器；XB-K-25血细胞计数板；SA3000型显微镜。

1.2 试验方法

1.2.1 初始药液的配制

采用超声波醇提法，提取供试植物醇提物：分别称取粉碎物10 g左右，加入500 mL 60%乙醇浸泡24 h，再经超声波提取30 min，抽滤。滤渣分别用150 mL 60%乙醇浸泡48 h、72 h后，再经超声波各处理30 min，抽滤，合并三次滤液，减压浓缩得浸膏，置4 ℃备用。无菌条件下，将上述4种浸膏分别用60%乙醇配成初始体积质量浓度为0.3 g/mL、0.15 g/mL、0.075 g/mL、0.035 g/mL、0.017 5 g/mL的初始药液。

1.2.2 木霉菌丝生长速度测定[8]

无菌条件下，用灭菌后的打孔器（直径=7 mm）打出一定数量的绿色木霉菌饼，备用。PDA培养基灭菌后，晾至45 ℃左右取9 mL培养基，分别与1 mL上述初始药液或60%乙醇（CK）混匀，然后倒平板，使得上述醇提物的药液终浓度为0.03 g/mL、0.015 g/mL、0.007 5 g/mL、0.003 5 g/mL、0.001 75 g/mL。将绿色木霉菌饼分别放置在处理组和对照组平板上，菌丝一面向下，每皿接3饼，置于28 ℃培养。待对照组菌丝长至平板一半长度时，后采用十字交叉法测量菌落直径，分别计算药液对菌落的生长抑制率。

1.2.3 孢子悬浮液测定[9]

无菌条件，用生理盐水冲洗长满绿色木霉孢子的平板，过滤，得孢子悬浮液。取6个装有8 mL PDA液体培养基的锥形瓶，分别加入1 mL孢子悬浮液，再分别加入1 mL不同体积质量浓度的初始药液或60%乙醇（CK），使得上述醇提物的药液终浓度达到0.03 g/mL、0.015 g/mL、0.007 5 g/mL、0.003 5 g/mL、0.001 75 g/mL，置28 ℃ 180 r/min振荡培养。

对照组孢子萌发（孢子芽管长度大于孢子短半径者为萌发）后，用无菌水稀释到适当倍数（10×10低倍镜下，每个视野30～40个孢子为宜）[10]，移至血细胞计数板上，在10×10倍显微镜下观测，计算药液对孢子萌发的抑制率：

孢子萌发抑制率（%）=（对照萌发数-处理萌发数）/对照萌发数×100%

2 结果与分析

2.1 不同处理供试绿色木霉菌株的生长菌丝情况

由图1可知，总体上，虽然襄麦冬醇提物对试验绿色木霉菌株菌丝生长有一定的抑制作用，但抑制效果有限：在观察的前22 h内，处理组菌落直径增长基本上同对照组（CK），尤其是在菌丝培养14～18 h的菌落直径基本呈线性增长。此外，在菌丝培养18～22 h，处理组菌落的增长速度呈前期突然升高（曲线斜率突然增大）而后期降低的趋势。分析其可能的原因为襄麦冬醇提物中的一些活性成分被绿色木霉代谢后将其利用，起到营养增效作用。因此出现菌丝生长加速现象，但是后阶段由于培养基的水分、营养等物质逐渐被消耗掉，所以菌落增长变缓。

图1 襄麦冬醇提物作用下绿色木霉菌株的菌落增长情况

由图2可知，鱼腥草醇提物对供试绿色木霉菌株的抑制活性较强，对照组的菌落增长速度较处理组的要快，且不同体积质量浓度药液对绿色木霉的抑制作用差异较大。同襄麦冬醇提物处理一样，在绿色木霉菌丝培养20 h之后，无论是处理组还是对照组，由于培养基的营养物质逐渐被消耗，菌落增长速度均开始变缓。

图2 鱼腥草醇提物作用下绿色木霉菌株的菌落增长情况

由图3可知，总体上，猫眼草醇提物处理组的绿色木霉菌落的增长速度，比襄麦冬醇提物处理组慢，但是比鱼腥草醇提物处理的菌落增长快，这反映了其对供试绿色木霉菌株的菌丝生长抑制活性介于襄麦冬醇提物与鱼腥草醇提物之间。同样，在绿色木霉菌丝培养14 h～18 h内，其菌落基本属于线性增长，在20 h以后菌落增长速度变缓。

图3 猫眼草醇提物作用下绿色木霉菌株的菌落增长情况

由图4可知，虽然五香菜醇提物对供试绿色木霉菌株菌丝生长有一定的抑制，但是抑制作用不显著，在菌丝培养前20 h内，菌落的直径增长速度较快，基本上属于线性增长。

图4 五香菜醇提物作用下绿色木霉菌株的菌落增长情况

2.2 不同植物醇提物对供试绿色木霉菌株的菌丝生长抑制活性比较

真菌菌丝在培养基上的生长与时间变化是非线性的，分析所用数据最好选择线性生长阶段采集的数据[11]。由于供试绿色木霉菌株在培养14～18 h内菌丝生长速度比较平稳，再考虑到其营养状况（每个平板只含有9 mL的PDA培养基，随观测时间延长，会出现菌株营养不良老化现象），以及供试药液的药效活性随观测时间延长，可能存在热分解、光分解现象[12-13]。因此，在统计不同植物醇提物平均抑制率时，只采用培养18～20 h的数据。

由表1可知，当醇提物体积质量浓度不低于0.015 g/mL时，鱼腥草、猫眼草醇提物对供试绿色木霉菌株的菌丝生长抑制率均超过30%，且在最高体积质量浓度0.03 g/mL时分别达47.23%、35.97%。襄麦冬和五香菜醇提物对供试绿色木霉菌株的菌丝生长抑制活性较弱，在最高体积质量浓度0.03 g/mL时仅为23.89%、23.12%。

表1 不同植物醇提取对绿色木霉菌菌丝生长抑制作用比较

2.3 不同植物醇提物对供试绿色木霉菌株的孢子萌发抑制活性比较

由表2可知，不同植物醇提物对供试绿色木霉菌株孢子萌发的抑制作用均随药液体积质量浓度的升高而增强。在最高体积质量浓度0.03 g/mL时，4种植物醇提取物的抑制活性均超过54%，其中鱼腥草的抑制率最高，为78.57%，猫眼草次之，为72.89%，五香菜、襄麦冬的抑制率分别为59.70%、54.07%。在最低体积质量浓度为0.001 75 g/mL时，鱼腥草、猫眼草对孢子萌发的抑制率仍超过20%。总体上，4种植物醇提物对供试绿色木霉菌株的孢子萌发抑制活性，与其对应的菌丝生长抑制活性的结果相一致。

表2 不同植物醇提取对绿色木霉菌株的孢子萌发抑制作用比较

3 小结

襄麦冬、鱼腥草、猫眼草和五香菜均为鄂西北地区常见植物种。有报道称襄麦冬提取物对灰葡萄孢菌、终极腐霉、立枯丝核菌的菌丝生长和孢子萌发有较好的抑制作用[14]。此外，研究也发现鱼腥草癸酰（Decanoylacetaldehyde）[15]、猫眼草七叶内酯（Aesculetin）及猫眼草素（Maoyancaosu）[16]以及五香菜挥发油具有较强的抗菌活性。试验结果表明，无论是襄麦冬、鱼腥草、猫眼草还是五香菜，其醇提物对供试绿色木霉菌株的菌丝生长和孢子萌发均具有一定的抑制作用，且抑制活性与醇提物的体积质量浓度呈正相关，均随药液浓度的升高而增强。鱼腥草、猫眼草的抑制作用最强，在最高体积质量浓度（0.03 g/mL），对菌丝生长的抑制率分别达47.23%、35.97%，对孢子萌发的抑制率达78.57%、72.89%。整体来看襄麦冬醇提物对供试菌株的抑制活性最弱，在最高体积质量浓度（0.03 g/mL）对菌丝生长抑制率仅为23.89%，对孢子抑制率为54.07%，显著低于其他处理组。