配伍比例及炮制方法对川楝子-小茴香药对中9 种成分含量的影响

侯建忠，朱顺娟，李 瑶，王小鹏，郝建明，曹云飞

（1.酒泉市药品检验检测中心，甘肃 酒泉 735008； 2.酒泉市中医院，甘肃 酒泉 735008； 3.镇江市食品药品监督检验中心，江苏 镇江 212000）

川楝子为楝科植物川楝MeliatoosendanSieb.etZucc.的干燥成熟果实，具有舒肝、行气止痛、驱虫的功效，用于治疗胸胁、脘腹胀痛、疝痛、虫积腹痛［1］。小茴香为伞形科植物茴香Foeniculum vulgareMill.的干燥成熟果实，具有散寒止痛、理气和胃的功效，用于治疗寒疝腹痛、睾丸偏坠、脘腹胀痛［1］。盐川楝子镇痛抗炎作用显著［2-3］，而盐小茴香可暖肾散寒止痛［4］，两者合用寒热兼施，用于治疗寒疝睾丸坠痛、妇女经行腹胀、小腹冷痛［5-6］。药理实验和临床实践都已证实，川楝子的治疗量与中毒量非常接近［7-8］，因此，临床上通常通过炮制和配伍的方式达到减毒增效的目的。盐川楝子-盐小茴香作为临床治疗寒疝睾丸坠痛的常用药对，其化学成分在不同配伍比例及炮制前后必然存在着一定的量变或质变，但目前缺乏相关研究。本实验通过比较不同配伍比例和炮制方法下川楝子-小茴香药对中9 种成分含量的变化，探讨其最佳比例，以期为临床安全有效地使用上述中药饮片提供参考。

1 材料

Agilent 1260 型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）； DFT-200 型手提式高速中药粉碎机（浙江屹立工贸有限公司）； TLC PLATE HEATER Ⅲ型加热板（瑞士Camag 公司）； XPE205DR 型电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）； KH-250DB 型超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）。

芦丁 （批号100080-201610，纯度91.9%）、阿魏酸（批号110773-201614，纯度99.0%）、川楝素（批号111842-201804，纯度96.9%）、反式茴香脑 （批号111835-201503）、α-蒎烯 （批号897-20001） 对照品均购自中国食品药品检定研究院； 槲皮素（批号22051613，纯度98%）、异槲皮素（批号TC0693-220808，纯度98%）、异川楝素（批号TC0385-221015，纯度98%）、山柰酚（批号TC0655-220722，纯度98%） 对照品均购自四川精粹天成药物科技有限公司。乙腈（色谱纯，德国默克公司）； 磷酸（分析纯，中国医药集团有限公司）； 水为纯净水。

川楝子（批号2207001，产地四川）、小茴香（批号20200730，产地甘肃） 饮片均购自酒泉市中医院，经酒泉市中医院郝建明主任中药师鉴定为正品。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液制备 制备方法见表1。分别精密称取各样品2 g，置于50 mL 具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，称定质量，超声（功率500 W，频率40 kHz） 提取2 h，放冷，甲醇补足减失的质量，摇匀，0.45 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

表1 制备方法Tab.1 Preparation methods

2.2 对照品溶液制备 精密称取各对照品适量，甲醇制成一定质量浓度的母液，混合，制成每1 mL分别含芦丁8.608 μg、阿魏酸9.624 μg、槲皮素7.536 μg、山柰酚7.560 μg、异槲皮素8.448 μg、川楝素113.292 μg、异川楝素10.811 μg、α-蒎烯721.500 μg、反式茴香脑499.6 μg 的溶液，即得。

2.3 色谱条件 ZORBAX SB C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流动相乙腈 （A） -0.1% 磷酸（B），梯度洗脱（0 ～8 min，83% ～75% B； 8 ～17 min，75% ～66% B； 17 ～35 min，66% ～58% B；35～46 min，58% ～75%B； 46 ～60 min，75% ～83%B）； 体积流量1.0 mL/min； 柱温30 ℃； 检测波长322 nm （0 ～5 min）、210 nm （5.1 ～38 min）、280 nm （38.1～60 min）； 进样量10 μL。色谱图见图1。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.4 线性关系考察 分别取“2.2” 项下对照品溶液2、5、10、15、20、25、30 μL，在 “2.3”项色谱条件下进样测定。以进样量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y） 进行回归，并以信噪比（S/N） ＝3 为检测限，S/N ＝10 为定量限，结果见表2，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.5 精密度试验 取“2.2” 项下对照品溶液适量，在“2.3” 项色谱条件下进样测定6 次，测得芦丁、异槲皮素、阿魏酸、槲皮素、异川楝素、山柰酚、川楝素、α-蒎烯、反式茴香脑峰面积RSD分别为0.08%、0.10%、0.13%、1.13%、0.99%、1.22%、0.06%、1.14%、0.95%，表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验 取生品川楝子-小茴香（1 ∶1）适量，按“2.1” 项下方法制备供试品溶液6 份，在“2.3” 项色谱条件下进样测定，测得芦丁、异槲皮素、阿魏酸、槲皮素、异川楝素、山柰酚、川楝素、α-蒎烯、反式茴香脑峰面积RSD 分别为1.32%、1.09%、1.11%、0.75%、0.84%、0.93%、1.92%、2.27%、2.04%，表明该方法重复性良好。

2.7 稳定性试验 取生品川楝子-小茴香（1 ∶1）适量，按“2.1” 项下方法制备供试品溶液，于0、2、8、16、24、32 h 在“2.3” 项色谱条件下进样测定，测得芦丁、异槲皮素、阿魏酸、槲皮素、异川楝素、山柰酚、川楝素、α-蒎烯、反式茴香脑峰面积 RSD 分别为 2.17%、1.56%、1.55%、1.38%、2.07%、2.31%、2.14%、2.81%、1.06%，表明溶液在32 h 内稳定性良好。

2.8 加样回收率试验 取各成分含量已知的生品川楝子-小茴香（1 ∶1） 6 份，每份约1 g，精密称定，按1 ∶1 比例精密加入各对照品适量，按“2.1” 项下方法制备供试品溶液，在“2.3” 项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，芦丁、异槲皮素、阿魏酸、槲皮素、异川楝素、山柰酚、川楝素、α-蒎烯、反式茴香脑平均加样回收率分别为96.68%、97.51%、96.19%、99.37%、101.51%、100.66%、98.26%、101.43%、103.13%，RSD 分别为1.86%、2.56%、2.14%、1.87%、1.91%、2.45%、2.00%、1.93%、2.67%。

2.9 样品含量测定 称取各样品粉末3 份，按“2.1” 项下方法制备供试品溶液，在“2.3” 项色谱条件下进样测定，计算含量，结果见表3。

表3 各成分含量测定结果（mg/g，±s，n＝3）Tab.3 Results for content determination of various constituents （mg/g，±s，n＝3）

表3 各成分含量测定结果（mg/g，±s，n＝3）Tab.3 Results for content determination of various constituents （mg/g，±s，n＝3）

注： —表示未检出。与生川楝子比较，**P＜0.01； 与生小茴香比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。

川楝子-小茴香芦丁异槲皮素阿魏酸槲皮素异川楝素生品1 ∶10.060 3±0.001 60.250 3±0.143 0△△0.025 9±0.001 10.071 5±0.000 60.142 4±0.085 4**清炒1 ∶10.060 8±0.000 80.229 0±0.132 7△△0.027 5±0.001 10.073 7±0.000 90.108 7±0.061 8**盐制1 ∶10.061 3±0.001 20.256 7±0.148 3△△0.022 6±0.001 40.077 6±0.001 80.111 4±0.064 3**生品1 ∶20.051 4±0.000 70.206 0±0.118 9△△0.020 2±0.001 60.071 8±0.000 80.107 8±0.062 0**清炒1 ∶20.059 9±0.001 40.199 1±0.115 2△△0.022 6±0.002 00.076 1±0.000 30.097 8±0.051 9**盐制1 ∶20.050 4±0.001 40.193 2±0.111 7△△0.028 6±0.001 20.075 5±0.001 70.092 2±0.469 2**生品2 ∶10.060 3±0.001 40.216 4±0.124 9△△0.022 4±0.001 10.070 6±0.001 70.117 3±0.068 4**清炒2 ∶10.060 2±0.001 80.225 3±0.130 3△△0.022 2±0.001 20.071 7±0.000 60.097 0±0.056 5**盐制2 ∶10.059 9±0.000 90.228 5±0.131 9△△0.022 2±0.000 70.071 7±0.002 00.115 0±0.066 4**生川楝子0.059 2±0.001 9—0.022 2±0.000 30.041 4±0.000 90.153 2±0.000 5生小茴香—0.160 4±0.001 6—0.029 1±0.000 5—川楝子-小茴香山柰酚川楝素α-蒎烯反式茴香脑生品1 ∶10.035 2±0.000 31.222 0±0.702 6**9.922 4±0.197 616.614 0±1.187 0清炒1 ∶10.036 6±0.000 31.209 2±0.698 0**7.341 1±0.112 5△14.388 0±1.185 2△盐制1 ∶10.037 0±0.000 11.208 6±1.105 6**7.492 5±0.026 1△14.430 2±1.162 2△生品1 ∶20.034 2±0.000 11.224 2±0.532 2**9.578 9±0.014 516.426 7±0.001 9清炒1 ∶20.034 6±0.000 41.220 8±0.545 1**7.261 7±0.886 3△14.407 2±2.090 1△盐制1 ∶20.035 0±0.000 11.157 9±0.002 8**7.779 9±0.885 4△14.933 4±1.923 4△生品2 ∶10.035 3±0.001 21.222 4±0.033 5**9.922 4±0.144 216.253 3±0.756 4清炒2 ∶10.035 9±0.000 81.152 3±0.857 2**7.341 2±0.131 3△13.991 4±2.036 3△盐制2 ∶10.035 0±0.000 81.055 6±1.332 5**7.492 5±0.053 4△13.141 6±2.003 1△生川楝子—1.412 3±0.003 9——生小茴香0.036 2±0.000 2—10.603 5±0.052 215.676 6±0.134 9

2.10 数据分析 将表3 中的数据采用SPSS 24.0软件进行处理，得到各成分总含量图和含量变化趋势图，见图2～3。

图2 川楝子-小茴香成分总含量（±s，n＝3）Fig.2 Total contents of constiuents in Toosendan Fructus and Foeniculi Fructus （±s，n＝3）

表3 显示，与生川楝子比较，其余样品中芦丁、阿魏酸、槲皮素含量升高，但差异无统计学意义（P＞0.05），川楝素、异川楝素含量降低（P＜0.01）； 与生小茴香比较，其余样品中山柰酚含量变化不明显，异槲皮素含量升高（P＜0.01），α-蒎烯、反式茴香脑含量降低（P＜0.05）。图2 显示，与川楝子-小茴香（0 ∶1＋1 ∶0） 比较，生品川楝子-小茴香（1 ∶1） 总含量高于其余样品（1 ∶2、2 ∶1） （P＜0.01），说明川楝子-小茴香1 ∶1配伍比例优于两者单用或1 ∶2、2 ∶1 配伍比例。清炒和盐制后，各样品总含量均降低，但两者之间各成分含量及总含量均无明显变化。图3 显示，炮制后芦丁、阿魏酸、槲皮素、山柰酚含量无明显变化，但异川楝素、川楝素、α-蒎烯、反式茴香脑含量降低，导致炮制品总含量低于生品。

图3 炮制品与生品各成分含量的变化趋势图Fig.3 Trend of changes in the content of various constiuents of the processed and raw products

3 讨论

3.1 色谱条件选择 参考文献［9-12］ 报道，流动相选择甲醇-水、甲醇-0.1% 磷酸、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸进行考察，最终确定了色谱峰峰型美观、分离度较好的乙腈-0.1%磷酸作为流动相。由于川楝子-小茴香药对中9 种成分含量差异较大，因此检测波长并不是所有化合物的最大吸收波长，如阿魏酸的最大吸收波长为322 nm，反式茴香脑的最大吸收波长为210 nm，为了兼顾含量较低化合物的出峰响应及峰面积积分的准确度，将反式茴香脑检测波长转换为280 nm，其余均采用210 nm。

3.2 结果分析 查阅文献［13-14］发现，盐川楝子-盐小茴香常以1 ∶1、1 ∶2、2 ∶1、6 ∶1 等比例配伍使用。本研究参考文献［15-20］ 报道，筛选出川楝子和小茴香中9 种主要活性成分作为检测指标，结果显示，川楝子、小茴香生品配伍合用较单用更有利于活性成分的溶出［21］，配伍及炮制后川楝素、异川楝素含量均降低，其原因可能是与其不稳定的半缩醛结构有关，加热过程造成了物质的分解，或是小茴香中存在“减其毒性” 的物质，有待进一步研究。α-蒎烯、反式茴香脑在炮制后含量降低，可能是由于它为挥发油类物质，受热易分解，炮制过程加速了这类物质的分解。川楝子、小茴香配伍、炮制后各成分发生了复杂的变化，而芦丁等9 种成分不能代表全部，因此，课题组后续将以筛选出的最佳配伍比例为基础，结合指纹图谱、波谱技术、药效学试验作进一步分析。