UPLC-MS/MS 法同时测定透骨香中6 种成分的含量

金 林，周祖英，周家华，迟明艳，郑 林，黄 勇，3*，黄 闻

（1.贵州医科大学，贵州省药物制剂重点实验室/药用植物功效与利用国家重点实验室，贵州 贵阳 550004； 2.贵州医科大学药学院，贵州 贵阳 550004； 3.国家苗药工程技术研究中心，贵州 贵阳 550004； 4.贵州医科大学附属医院烧伤整形外科，贵州 贵阳 550001）

透骨香为杜鹃花科植物滇白珠Gaultheria leucocarpavar.yunnanensis的干燥全株，主要分布于云南、贵州、广西、四川等地区，全株均可入药，其性平、味辛，具有祛风除湿、清热解毒、散寒止痛等作用［1］。目前，关于透骨香抗炎镇痛［2-3］、抗类风湿关节炎［4-5］等药理作用的报道较多，并且也是苗族民间治疗类风湿病的习用药材［6］，但目前各省标准对于其用药部位并不统一［1，7-8］。

目前，在透骨香质量控制方面的研究除了TLC鉴别外，大多为理化鉴别［9］及其中单一成分或大类成分的含量测定，如总黄酮［10］、总酚酸［10］、槲皮素［11］、水杨酸甲酯［12］等，Wang 等［13］测定了透骨香中抗风湿部分及其代谢产物的含量，但并未对其他成分进行分析； Liu 等［14］采用HPLC 指纹图谱结合化学计量学对透骨香和其他6 种滇白珠属植物进行鉴定，但不能用于比较不同批次透骨香之间的质量差异； 蒲健等［15］采用GC-MS 法检测透骨香根、茎叶中化学成分，发现槲皮苷［16］、绿原酸［17］、滇白珠苷A［18］、原儿茶酸［18］、表儿茶素［18］、白珠树苷［19］是其药理活性、质量控制的主要物质。本实验采用UPLC-MS/MS 法同时测定透骨香中原儿茶酸、表儿茶素、绿原酸、槲皮苷、白珠树苷、滇白珠苷A 的的含量，以期为提升该药材质量控制水平提供参考。

1 材料

1.1 仪器 ACQUITY UPLC H-Class 超高效液相色谱仪串联Xevo TQS 三重四极杆质谱仪，配置Masslynx4.1 质谱工作站（美国Waters 公司）； EL-204 电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）； 微量移液器（德国Eppendorf 公司）。

1.2 试剂与药物 透骨香共38 批，具体见表1，经贵州医科大学药学院刘春花副教授鉴定为杜鹃花科白珠树属植物滇白珠Gaultherialeucocarpavar.yunnanensis的干燥全草。绿原酸、原儿茶酸、槲皮苷对照品 （中国食品药品检定研究院，批号110753-201817、111538-201606、111538-201606）；表儿茶素对照品（成都埃法生物科技有限公司，批号AF8030805）； 白珠树苷、滇白珠苷A 对照品（自制，批号20190233），纯度均≥98%。其他试剂均为分析纯。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 对照品溶液 精密称取各对照品适量，甲醇稀释至10 mL，分别得含绿原酸1.020 g/L、原儿茶酸1.035 g/L、表儿茶素1.018 g/L、槲皮苷0.878 g/L、白珠树苷1.030 g/L、滇白珠苷A 1.116 g/L 的贮备液，量取适量，分别稀释至0.012、0.041、0.101、0.137、0.077、0.071 mg/mL，混合，2 倍稀释法稀释，即得，在-20 ℃下保存。

2.1.2 供试品溶液 取透骨香粉末（过40 目筛）约0.2 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，称定质量，加热回流2 h，放冷，50%甲醇补足减失的质量，取5 mL 定容至25 mL，摇匀，12 000 r/min 离心10 min，取上清液，即得。

2.2 UPLC-MS/MS 条件

2.2.1 色谱 Waters BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）； 流动相水 （含0.1% 甲酸）（A） -乙腈（含0.1%甲酸） （B），梯度洗脱（0 ～0.5 min，10% B； 0.5 ～2.5 min，10% ～40% B；2.5～4 min，40% ～90% B； 4 ～4.5 min，90% B；4.5 ～6 min，90% ～10% B）； 体积流量0.30 mL/min； 柱温40 ℃； 进样量1 μL。

2.2.2 质谱 电喷雾离子源； 毛细管电压3.0 kV； 离子源温度120 ℃； 喷雾气、反吹气N2； 脱溶剂气体积流量650 L/h； 去溶剂化气温度350 ℃；多反应监测（MRM） 模式，其他参数见表2。

表2 各成分质谱参数Tab.2 Mass spectrometry parameters for various constituents

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性考察 精密吸取对照品溶液、供试品溶液、空白溶剂 （50% 甲醇） 各1 μL，在“2.2” 项条件下进样测定，结果见图1。由此可知，供试品、对照品溶液中各成分色谱峰保留时间一致，空白溶剂无干扰，表明该方法专属性良好。

图1 各成分提取离子流色谱图Fig.1 Extracted ion current chromatograms of various constituents

2.3.2 线性关系考察 精密吸取“2.1.1” 项下对照品溶液适量，在“2.2” 项条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y） 进行回归，并以信噪比（S/N） ＝3 为检测限，S/N＝10 为定量限，结果见表3，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表3 各成分线性关系Tab.3 Linear relationships of various constituents

2.3.3 精密度试验 取“2.1.1” 项下对照品溶液适量，在“2.2” 项条件下进样测定6 次，连续3 d，测得原儿茶酸、表儿茶素、绿原酸、槲皮苷、白珠树苷、滇白珠苷A 日内精密度RSD 分别为1.1%、1.3%、2.1%、1.7%、1.1%、1.2%，日间精密度RSD 分别为1.9%、1.1%、2.3%、1.6%、1.5%、1.8%，表明仪器精密度良好。

2.3.4 稳定性试验 取同一份供试品溶液，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.2” 项条件下进样测定，测得原儿茶酸、表儿茶素、绿原酸、槲皮苷、白珠树苷、滇白珠苷A 峰面积RSD 分别为1.8%、2.6%、2.1%、1.8%、1.7%、2.8%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.3.5 重复性试验 精密称取同一批本品（黔西1），按“2.1.2” 项下方法制备6 份供试品溶液，在“2.2” 项条件下进样测定，测得原儿茶酸、表儿茶素、绿原酸、槲皮苷、白珠树苷、滇白珠苷A含量RSD 分别为1.4%、2.1%、1.2%、1.6%、2.3%、2.1%，表明该方法重复性良好。

2.3.6 加样回收率试验 精密称取各成分含量已知的本品适量，共6 份，精密加入对照品溶液适量，按“2.1.2” 项下方法制备6 份供试品溶液，在“2.2” 项条件下进样测定，计算回收率。结果，原儿茶酸、表儿茶素、绿原酸、槲皮苷、白珠树苷、滇白珠苷 A 平均加样回收率分别为101.88%、101.34%、99.88%、99.93%、99.91%、98.76%，RSD 分别为2.5%、1.4%、1.2%、1.1%、1.0%、2.4%。

2.4 样品含量测定 取38 批样品，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.2” 项条件下进样测定，计算含量，结果见表4。

表4 各成分含量测定结果（mg/g，n＝3）Tab.4 Results for content determination of various constituents （mg/g，n＝3）

2.5 层次聚类分析（HCA）、主成分分析（PCA）采用Ward 法，选择欧几里德距离作为度量，并按变量Z值得分标准化后进行HCA 分析，结果见图2。由此可知，38 批样品分为2 个主要簇Ⅰ、Ⅱ，簇Ⅰ包括根，簇Ⅱ包括地上部分，表明两者所含成分有较大差异。

图2 系统聚类分析树状图Fig.2 Dendrogram of system cluster analysis

PCA 分析以6 种成分为变量，载荷图、得分图分别见图3A～3B。如图3A 所示，表儿茶素、白珠树苷、原儿茶酸刚好分布在3 个方向上，并且各自与原点的距离都较近，表明三者含量之间无相关性，可能是引起药材质量变化的重要因素。如图3B 所示，不同地区根部药材主要在成分2 （PC2）轴方向上发生纵向偏移，而不同地区地上部分药材主要向第一象限偏移，可能与这些方向上的变量（如表儿茶素、白珠树苷、原儿茶酸等） 有关，与图3A 一致。另外，在成分1 （PC1） 方向上滇白珠苷A 与槲皮苷、绿原酸处在两极，表明后两者含量越高，前者含量越低，反之亦然，这种相关性明显的变量将根和地上部分明显区分成2 个部分； 对于表儿茶素、白珠树苷、原儿茶酸而言，其含量对不同部位药材成分含量的贡献相近，总有1种成分会占据主导地位，而且与其他两者无关，这种相关性不明显的变量在很大程度上形成了不同地区同一部位药材的质量差异。

图3 主成分分析图Fig.3 Principal component analysis diagrams

同时，白珠树苷在地上部分中的含量［（2.127± 1.275） mg/g］ 高于在根中的含量［（1.318±1.075） mg/g］ （P＜0.05），并且在发生偏离批次的地上部分中其含量高于其他批次地上部分中，它们主要来自于毕节，由于当地位于贵州西部地区，地势比贵阳等中部地区高一千多米，年平均气温更低，推测上述环境可能更有利于该成分在地上部分的累积。除此之外，原儿茶酸、表儿茶素是不同批次药材根所含成分发生偏移的主要因素，都匀产药材中表儿茶素含量整体高于其他地区药材中，当地位于贵州南部纬度较低的地区，气候更温暖湿润，推测上述环境可能更适合该成分在根中的累积； 原儿茶酸整体含量偏低，在其影响下得分发生偏移的主要是贵阳地区药材根。

3 讨论

3.1 分析方法选择 UPLC-MS/MS 法具有选择性强、灵敏度高、分离性能好等优势，目前已广泛应用于中药及其复方制剂成分定性定量分析、中药材质量控制等方面［20］，它可检测含量较低的成分，而且多反应监测模式可很好地分离保留时间非常接近的化合物，互不影响［21］。本实验首次采用该方法，在负离子扫描、MRM 模式下测定离子对，发现定量离子峰形良好，其他物质无干扰，能准确分析待测成分。

3.2 分析条件优化 本实验考察了不同色谱柱［Waters BEH C18、Thermo Hypersil Gold （2.1 mm×100 mm，1.7 μm）］、流动相 ［甲醇-水、乙腈-水、乙腈（含0.1%甲酸） -水（含0.1%甲酸）］、体积流量 （0.2、0.3、0.4 mL/min），发现采用Waters BEH C18色谱柱、流动相乙腈-水（含0.1%甲酸）、体积流量0.3 mL/min 进行梯度洗脱时，各成分色谱峰分离度、峰形较好。另外，各成分在负离子模式下的响应均较高，故本实验采用该监测模式。

3.3 指标成分选择 张颖等［16］对透骨香止泻活性部位进行分析，鉴定出槲皮苷，推测它可能是发挥作用的主要成分之一。李晓等［17］发现，透骨香中绿原酸等4 种成分具有抗炎镇痛活性，并对其进行含量测定。刘慧等［18］对金骨莲胶囊及其组方单味药材的HPLC 色谱图进行比较，发现原儿茶酸、表儿茶素、绿原酸、滇白珠苷A 是透骨香药效成分。Wang 等［19］测定透骨香中7 种抗风湿性关节炎成分含量，发现白珠树苷最高，达63.53 μg/mg。因此，本实验选择与透骨香药理作用密切相关的原儿茶酸、表儿茶素、绿原酸、槲皮苷、白珠树苷、滇白珠苷A 作为指标成分。

4 结论

本实验建立UPLC-MS/MS 法同时测定透骨香中原儿茶酸、表儿茶素、绿原酸、槲皮苷、白珠树苷、滇白珠苷A 的含量，能较系统全面地研究不同来源、部位药材之间的质量差异，该方法准确可靠，专属性强，易于操作，并发现白珠树苷、表儿茶素、原儿茶酸可能是不同产地药材产生差异的质量标志物，可为其质量标准研究提供参考。